張莉,張開炯,吳立春,杭永倫

610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學醫(yī)學院 檢驗科(張莉、吳立春);646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 檢驗科(張開炯、杭永倫)

乳腺癌是女性最常見的惡性程度較高的腫瘤[1]。根據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計資料顯示，乳腺癌的發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤的首位，病死率位居第4，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2]。隨著手術、放化療等治療水平的提高，乳腺癌患者的總體生存率有了較大的改善，但乳腺癌起病隱匿且惡性程度高，當患者出現(xiàn)了典型癥狀時往往己處于腫瘤中晚期，此時治療效果不甚理想，嚴重影響患者的預后[3-4]。因此，尋找便捷且高效能的乳腺癌診斷標志物迫在眉睫[5]。

近年來，研究者們對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認識越來越深入，已經從蛋白編碼基因逐漸拓展到非編碼基因，如非編碼RNA(non-coding RNA)[6-7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，廣泛地參與了包括細胞周期調控、細胞凋亡和分化及表觀遺傳等生物學進程[8]。LncRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)腫瘤組織和細胞中存在若干特異性表達的lncRNAs，這些lncRNAs不僅能將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開，而且其表達水平還與腫瘤分子亞型、分化程度、侵襲轉移及預后程度密切相關[9-10]。近年來已有若干乳腺癌相關的lncRNA相繼被報道[10-11]，而如何尋找一種特異性更高靈敏度更強的lncRNA用作乳腺癌的特異性診斷，值得我們進一步探索和深入研究。

目前，如何找到方便有效的腫瘤篩查和預防分子標記一直是腫瘤研究的重點?；蛐酒鳛橐环N高效、大規(guī)模的生物信息學技術，可以檢測和分析腫瘤組織與正常組織之間差異表達的基因，為篩選新的腫瘤標志物提供機會。為了從分子水平了解乳腺癌的發(fā)病機制，為乳腺癌的篩查和防治提供新的靶點,我們采用R語言Limma函數(shù)包，對美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)平臺公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌基因芯片表達數(shù)據(jù)集進行分析，鑒定乳腺癌中具有顯著差異的lncRNA并重新注釋，分析其表達以篩選乳腺癌相關的lncRNA，并采用定量PCR的方法進一步驗證其表達情況，以評價基因芯片篩選結果的可靠性，從而為乳腺癌生物標志物的篩選提供策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本的收集

選取四川省腫瘤醫(yī)院2015年5月～2016年9月初診的乳腺癌女性患者50例，采集患者腫瘤組織標本及其對應癌旁組織標本(距腫瘤大于5cm)。 患者年齡27～69歲，中位年齡48歲。研究獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準。全部病例通過病理確診，術前未進行放、化療等任何治療，病例資料齊全。

1.2 主要試劑與設備

1.2.1 主要試劑組織 RNA提取試劑盒(大連寶生物)，PrimeScriptTM RT reagent Kit(大連寶生物)，SYBR?Premix Ex TaqTM II擴增試劑盒(大連寶生物)，PCR引物(上海生工)。

1.2.2 主要設備 C1000TM Thermal Cycle PCR儀(Bio-RAD，美國)，ABI7500Fast熒光定量PCR儀器(ABI，美國)，NanoDrop ND-2000紫外分光光度計(Thermo，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳腺癌中差異表達lncRNA分析 從NCBI的GEO公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺下載乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)GSE33447，包含8對乳腺癌組織及正常組織，采用Limma函數(shù)包對乳腺癌差異表達的lncRNA進行分析，以FC≥2，adj.P<0.05為篩選標準。為了提高數(shù)據(jù)的可靠性，采用DNA元件百科全書(ENCODE)對篩選出的差異表達的lncRNA進一步注釋，只保留ENCODE中包含的lncRNA。

1.3.2 標本制備 乳腺癌患者新鮮組織標本及相鄰的對照組織切下后迅速液氮冷凍，并儲存于-80℃冰箱備用。

1.3.3 總RNA的提取及表達水平檢測 按照TRIZOL 法提取組織中的總RNA(按照試劑說明書進行操作)，用紫外分光光度法測定總RNA濃度和純度，剔除不合格標本不參與后續(xù)實驗，并將其逆轉錄為cDNA儲存以備用。選取組織中穩(wěn)定表達的β-actin作為內參。引物序列由NCBI引物在線工具進行設計，經BLAST比對后送上海生工合成。采用寶生物試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)進行逆轉錄反應，并進一步采用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒，ABI7500實時定量PCR擴增儀擴增cDNA。引物序列見表1。

表1實時熒光定量PCR引物序列

Table 1. Primer sequences of real-time PCR

NameGenBank NumberPrimer sequenceβ-actinNM_001101Forward: 5'-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'Reverse: 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'MNX1-AS1NR_038835.1Forward: 5'-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3'Reverse: 5'-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3'MIATNR_003491.3Forward:5'-TTTACTTTAACAGACCAGAA-3'Reverse:5'-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3'HOXA11-ASNR_002795.2Forward: 5'-GAGTTTGAAGCCGTGGATGT-3'Reverse: 5'-AGATGAGGGGAGAGGTGGAT-3'PGM5-AS1NR_015423.2Forward: 5'-TTTTGCCATCAGCGAACAGC-3'Reverse: 5'-CAGGACAGTAGCCTTGGTGG-3'LINC00908NR_015417.1Forward: 5'-CACGGTGTGTTTGTGAGCTG-3'Reverse: 5'-CCTTGGTACACGAGGCCTTT-3'AC226118.1NR_033960.1Forward: 5'-CAAAGCCTCCTGCTGAGTGA-3'Reverse: 5'-CTTGCTCAGAGGGGTGAGTG-3'

1.3.4 生物信息學分析 采用starbase 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)進行l(wèi)ncRNAs靶基因預測；采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對lncRNAs靶基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)和KEGG信號通路富集分析。

2 結 果

2.1 乳腺癌差異表達的lncRNA

采用Limma函數(shù)包對乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447進行差異分析，發(fā)現(xiàn)227個差異表達的lncRNA，其中135個lncRNA表達上調，92個lncRNA表達下調(FC≥2，adj.P<0.05)。差異表達的lncRNA如圖1。由于芯片所檢測出的lncRNA大部分信息和功能未知，我們進一步采用NONCODE對差異表達的lncRNA進行注釋，為確保所篩選出的lncRNA結果可靠，剔除沒有被ENCODE所收錄的45個lncRNA，只保留ENCODE中包含的47個差異表達的lncRNA，在47個差異表達的lncRNA中，17個表達上調，30個表達下調，結果見表2。

表2 ENCODE中47個乳腺癌差異表達的lncRNAs

Table 2. Forty-seven differentially expressed lncRNAs of breast cancer included in GENCODE

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValMNX1-AS1ENST00000480284Up-regulation7.140.014MIATENST00000613780Up-regulation5.120.019LINC00922ENST00000569736Up-regulation4.860.027LINC00487ENST00000382045Up-regulation4.420.046HOXA11-ASENST00000522674Up-regulation4.260.002H19ENST00000414790Up-regulation4.140.020ZFHX4-AS1ENST00000518143Up-regulation3.980.035LEF1-AS1ENST00000512637Up-regulation3.680.008RP11-46107.1ENST00000501259Up-regulation3.580.014RP11-690C23.2ENST00000366308Up-regulation3.140.014USP30-AS1ENST00000478808Up-regulation2.860.005CDKN2A-AS1ENST00000441769Up-regulation2.800.009CACTIN-AS1ENST00000592274Up-regulation2.380.008ZNF252P-AS1ENST00000527067Up-regulation2.360.020FBXL19-AS1ENST00000563777Up-regulation2.160.040RP11-383H13.1ENST00000518700Up-regulation2.100.007BAALC-AS2ENST00000436771Up-regulation2.020.004PROSER2-AS1ENST00000445498Down-regulation2.020.009SERTAD4-AS1ENST00000437764Down-regulation2.040.030LINC00271ENST00000421378Down-regulation2.040.021ZMIZ1-AS1ENST00000456353Down-regulation2.080.012ZNF436-AS1ENST00000335648Down-regulation2.080.024LINC00924ENST00000556053Down-regulation2.120.021ZNF667-AS1ENST00000299997Down-regulation2.120.041ARHGAP5-AS1ENST00000553596Down-regulation2.320.009BDNF-ASENST00000499008Down-regulation2.400.007STX17-AS1ENST00000529965Down-regulation2.420.021RP11-181C3.1ENST00000501499Down-regulation2.500.040MIR17HGENST00000582141Down-regulation2.600.010MIRLET7BHGENST00000360737Down-regulation2.620.028RP11-617D20.1ENST00000440181Down-regulation2.740.044ADD3-AS1ENST00000369655Down-regulation2.900.020EPB41L4A-AS1ENST00000413221Down-regulation2.960.002LINC01549ENST00000440664Down-regulation3.120.035LINC01140ENST00000490006Down-regulation3.200.044LINC00640ENST00000554409Down-regulation3.200.009

(Table 2 continues on next page) (continued from previous page)

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValLINC01197ENST00000508732Down-regulation3.320.032LINC00284ENST00000592085Down-regulation3.480.024FGF14-AS2ENST00000606448Down-regulation3.700.005LINC00323ENST00000441268Down-regulation3.740.005RP11-161M6.2ENST00000563863Down-regulation3.800.015FGF13-AS1ENST00000438238Down-regulation4.280.005LINC01235ENST00000604724Down-regulation4.300.017HOXA-AS3ENST00000518947Down-regulation4.720.001LINC00908ENST00000578613Down-regulation5.380.018AC226118.1ENST00000515213Down-regulation5.620.001PGM5-AS1ENST00000417887Down-regulation6.100.010

圖1 8對乳腺腫瘤組織及其癌旁對照組織中差異表達lncRNA聚類分析圖

Figure 1. A comparison between differentially expressed lnsRNA profiles in 8 breast cancer tissue and those in 8 normal breast tissue:Hierarchical clustering

2.2 lncRNAs參與的生物信息學功能分析

采用starbase 2.0對47個差異表達的lncRNAs靶基因進行預測，并采用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達lncRNAs靶基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，以了解差異基因所具有的生物學意義以及所參與的重要生物學途徑。結果如圖2、圖3所示。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs廣泛地參與了基因的轉錄及轉錄后調控、基因沉默及細胞代謝等生物學進程；通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs參與了乳腺癌、膀胱癌以及前列腺癌進程，并參與了PI3K-Akt、Ras、TNF以及p53等信號通路。

圖2 GO富集分析乳腺癌中異常表達的lncRNAs

Figure 2. GO enrichment analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

圖3 KEGG信號通路分析乳腺癌中差異表達的lncRNAs

Figure 3. KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

2.3 采用qRT-PCR方法驗證lncRNAs在乳腺癌組織中的表達水平

為了明確生物信息學篩選的可靠性，分別選取乳腺癌中3個高表達(MNX1-AS1，MIAT，HOXA11-AS)和3個低表達(PGM5-AS1，LINC00908，AC226118.1)的lncRNA，采用qRT-PCR的方法檢測其在50例乳腺癌病理組織和50例癌旁組織中的表達水平，采用t檢驗對差異表達的lncRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS在乳腺癌病理組中的表達水平明顯高于其癌旁非腫瘤對照組，而PGM5-AS1、LINC00908和AC226118.1在乳腺癌病理組中的表達水平低于其癌旁非腫瘤對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，結果如圖4。

圖4 LncRNAs在乳腺癌組織中相對于癌旁組織的表達水平

Figure 4. Comparision between relative expression levels of lncRNAs in breast cancer tissue and those in control tissue

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 評價lncRNA潛在診斷價值

為了評價lncRNA作為診斷標志物的潛在價值，我們選取乳腺癌中高表達的MNX1-AS1作為研究對象，利用SigmaPlot 12.5進行ROC曲線繪制，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.921，當cut-off為1.425時，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。結果如圖5。

圖5 MNX1-AS1對乳腺癌的潛在診斷價值

Figure 5. Potential diagnostic value of MNX1-AS1 for breast cancer

3 討 論

LncRNA廣泛地被報道參與人類許多疾病的發(fā)生，如腫瘤[12]、自身免疫性疾病[13]、炎癥和感染[14]等。目前，lncRNA的檢測方法主要為lncRNA特異芯片[15]、tiling芯片[16]以及RNA-seq測序[17]等，然而這些方法價格不菲，且需要特殊儀器檢測。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)通過對現(xiàn)有基因芯片進行再分析，能夠挖掘到芯片原使用者不曾注意到的信息，從而發(fā)揮更大的效用[18-19]。通過篩選GEO數(shù)據(jù)庫中含有l(wèi)ncRNA探針的芯片并重新注釋，可以得到其匹配的lncRNA的名稱，以分析lncRNA的表達情況。這種方法可以充分利用現(xiàn)有豐富的基因芯片數(shù)據(jù)資源，同時也節(jié)省了研究成本。

本研究選取乳腺癌相關基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447，利用基于R語言的Limma函數(shù)包對基因芯片原始數(shù)據(jù)進行分析，獲得每個探針的倍數(shù)變化值。根據(jù)該值，篩選差異表達的探針以獲得相應轉錄物的表達值。最后，通過實時熒光定量PCR進一步驗證差異表達的lncRNA。通過分析基因芯片數(shù)據(jù)，共篩選出227個差異表達的lncRNAs，其中135個lncRNAs上調，92個lncRNAs下調。雖然這些lncRNA具有明確的名稱，但大部分基因功能并不十分清楚。為了確保這些lncRNAs的可靠性，采用ENCODE對篩選出的差異表達的lncRNA進一步注釋，只保留ENCODE中包含的47個差異表達的lncRNA，其中17個表達上調，30個表達下調。

近年來，已有少量本文中所篩選出的差異表達lncRNA在乳腺癌中的報道。例如MIAT、H19、HOXA11-AS等。Luan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MIAT在乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中表達增高，且MIAT 表達水平與TNM分期和淋巴結轉移相關。敲除MIAT可體外抑制乳腺癌細胞增殖、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及侵襲轉移進程，并促進乳腺癌細胞凋亡，且在體內抑制腫瘤生長。隨后，Alipoor等[21]進一步研究發(fā)現(xiàn)，高表達的MIAT可作為乳腺癌診斷和治療的新型腫瘤標志物。Vennin等[22]發(fā)現(xiàn)，H19在乳腺癌中表達增高，高表達的H19可通過H19/miR-675軸調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移以及腫瘤的遠端轉移。Zhou等[23]研究證實，H19可通過差異海綿吸附的方式競爭結合miR-200b/c和let-7b，從而調控乳腺癌細胞EMT和間質-上皮轉化(MET)及侵襲轉移進程，抑制H19將降低乳腺癌的遠端轉移。目前，已有較多HOXA11-AS在多種腫瘤中異常高表達的報道。例如非小細胞肺癌[24]、結直腸癌[25]、胃癌[26]及宮頸癌[27]等，其表達水平與腫瘤細胞的侵襲和轉移顯著相關。最近，Li等[28]采用qRT-PCR的方法對50例乳腺癌組織及其癌旁組織中的HOXA11-AS進行檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的HOXA11-AS明顯高于癌旁對照組織。敲除HOXA11-AS可在體內體外抑制EMT相關分子標志物(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin)，從而抑制EMT進程，進而影響腫瘤細胞的侵襲轉移[28]。通過上述文獻報道，初步證實了采用生物信息學方法篩選差異表達目的基因的可靠性。

為了進一步確認生物信息學篩選基因芯片結果的可靠性，我們選取乳腺癌中暫無報道的MNX1-AS1、PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1，以及已經在乳腺癌中報道的MIAT，HOXA11-AS，采用qRT-PCR的方法驗證這些lncRNA在乳腺癌中的表達水平。結果顯示，乳腺癌組織中MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS表達增加；PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義。為了評價lncRNA作為診斷標志物的潛在價值，我們對乳腺癌中高表達的MNX1-AS1繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)AUC為0.921，當cut-off為1.425時，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。由此可見，通過生物信息學方法篩選腫瘤相關lncRNA，在解決研究的盲目性以及節(jié)約時間和成本上起到一定的作用，也可為lncRNA與乳腺癌之間進一步研究提供理論依據(jù)。

綜上所述，通過生物信息學方法可為篩選腫瘤相關lncRNA提供一個方便、快捷的途徑，為尋找腫瘤新型標志物提供了新的思路，為后續(xù)實驗奠定了基礎。在后續(xù)研究中，我們將進一步擴大樣本，分析lncRNA與乳腺癌病理類型、TNM分期、淋巴結轉移、雌激素以及孕激素水平等相關性，并進行細胞功能實驗明確lncRNA所具有的生物學功能和參與的信號通路，為lncRNA作為乳腺癌新型生物標志物以及臨床轉化提供依據(jù)。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應責任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(CNKI)科技期刊學術不端文獻檢測系統(tǒng)學術不端檢測；

同行評議：經同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。