張莉,張開炯,吳立春,杭永倫

610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科(張莉、吳立春);646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科(張開炯、杭永倫)

乳腺癌是女性最常見的惡性程度較高的腫瘤[1]。根據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)資料顯示，乳腺癌的發(fā)病率位居我國(guó)女性惡性腫瘤的首位，病死率位居第4，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2]。隨著手術(shù)、放化療等治療水平的提高，乳腺癌患者的總體生存率有了較大的改善，但乳腺癌起病隱匿且惡性程度高，當(dāng)患者出現(xiàn)了典型癥狀時(shí)往往己處于腫瘤中晚期，此時(shí)治療效果不甚理想，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[3-4]。因此，尋找便捷且高效能的乳腺癌診斷標(biāo)志物迫在眉睫[5]。

近年來(lái)，研究者們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，已經(jīng)從蛋白編碼基因逐漸拓展到非編碼基因，如非編碼RNA(non-coding RNA)[6-7]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于 200 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA，廣泛地參與了包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和分化及表觀遺傳等生物學(xué)進(jìn)程[8]。LncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)腫瘤組織和細(xì)胞中存在若干特異性表達(dá)的lncRNAs，這些lncRNAs不僅能將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開，而且其表達(dá)水平還與腫瘤分子亞型、分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后程度密切相關(guān)[9-10]。近年來(lái)已有若干乳腺癌相關(guān)的lncRNA相繼被報(bào)道[10-11]，而如何尋找一種特異性更高靈敏度更強(qiáng)的lncRNA用作乳腺癌的特異性診斷，值得我們進(jìn)一步探索和深入研究。

目前，如何找到方便有效的腫瘤篩查和預(yù)防分子標(biāo)記一直是腫瘤研究的重點(diǎn)。基因芯片作為一種高效、大規(guī)模的生物信息學(xué)技術(shù)，可以檢測(cè)和分析腫瘤組織與正常組織之間差異表達(dá)的基因，為篩選新的腫瘤標(biāo)志物提供機(jī)會(huì)。為了從分子水平了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為乳腺癌的篩查和防治提供新的靶點(diǎn),我們采用R語(yǔ)言Limma函數(shù)包，對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)平臺(tái)公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳腺癌基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，鑒定乳腺癌中具有顯著差異的lncRNA并重新注釋，分析其表達(dá)以篩選乳腺癌相關(guān)的lncRNA，并采用定量PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)基因芯片篩選結(jié)果的可靠性，從而為乳腺癌生物標(biāo)志物的篩選提供策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的收集

選取四川省腫瘤醫(yī)院2015年5月～2016年9月初診的乳腺癌女性患者50例，采集患者腫瘤組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(距腫瘤大于5cm)。 患者年齡27～69歲，中位年齡48歲。研究獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。全部病例通過(guò)病理確診，術(shù)前未進(jìn)行放、化療等任何治療，病例資料齊全。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 主要試劑組織 RNA提取試劑盒(大連寶生物)，PrimeScriptTM RT reagent Kit(大連寶生物)，SYBR?Premix Ex TaqTM II擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物)，PCR引物(上海生工)。

1.2.2 主要設(shè)備 C1000TM Thermal Cycle PCR儀(Bio-RAD，美國(guó))，ABI7500Fast熒光定量PCR儀器(ABI，美國(guó))，NanoDrop ND-2000紫外分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳腺癌中差異表達(dá)lncRNA分析 從NCBI的GEO公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)下載乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)GSE33447，包含8對(duì)乳腺癌組織及正常組織，采用Limma函數(shù)包對(duì)乳腺癌差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行分析，以FC≥2，adj.P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。為了提高數(shù)據(jù)的可靠性，采用DNA元件百科全書(ENCODE)對(duì)篩選出的差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)一步注釋，只保留ENCODE中包含的lncRNA。

1.3.2 標(biāo)本制備 乳腺癌患者新鮮組織標(biāo)本及相鄰的對(duì)照組織切下后迅速液氮冷凍，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.3.3 總RNA的提取及表達(dá)水平檢測(cè) 按照TRIZOL 法提取組織中的總RNA(按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作)，用紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度和純度，剔除不合格標(biāo)本不參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA儲(chǔ)存以備用。選取組織中穩(wěn)定表達(dá)的β-actin作為內(nèi)參。引物序列由NCBI引物在線工具進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對(duì)后送上海生工合成。采用寶生物試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并進(jìn)一步采用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒，ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增cDNA。引物序列見表1。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

Table 1. Primer sequences of real-time PCR

NameGenBank NumberPrimer sequenceβ-actinNM_001101Forward: 5'-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'Reverse: 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'MNX1-AS1NR_038835.1Forward: 5'-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3'Reverse: 5'-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3'MIATNR_003491.3Forward:5'-TTTACTTTAACAGACCAGAA-3'Reverse:5'-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3'HOXA11-ASNR_002795.2Forward: 5'-GAGTTTGAAGCCGTGGATGT-3'Reverse: 5'-AGATGAGGGGAGAGGTGGAT-3'PGM5-AS1NR_015423.2Forward: 5'-TTTTGCCATCAGCGAACAGC-3'Reverse: 5'-CAGGACAGTAGCCTTGGTGG-3'LINC00908NR_015417.1Forward: 5'-CACGGTGTGTTTGTGAGCTG-3'Reverse: 5'-CCTTGGTACACGAGGCCTTT-3'AC226118.1NR_033960.1Forward: 5'-CAAAGCCTCCTGCTGAGTGA-3'Reverse: 5'-CTTGCTCAGAGGGGTGAGTG-3'

1.3.4 生物信息學(xué)分析 采用starbase 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)進(jìn)行l(wèi)ncRNAs靶基因預(yù)測(cè)；采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)lncRNAs靶基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)和KEGG信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌差異表達(dá)的lncRNA

采用Limma函數(shù)包對(duì)乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)227個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中135個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，92個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)(FC≥2，adj.P<0.05)。差異表達(dá)的lncRNA如圖1。由于芯片所檢測(cè)出的lncRNA大部分信息和功能未知，我們進(jìn)一步采用NONCODE對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行注釋，為確保所篩選出的lncRNA結(jié)果可靠，剔除沒(méi)有被ENCODE所收錄的45個(gè)lncRNA，只保留ENCODE中包含的47個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，在47個(gè)差異表達(dá)的lncRNA中，17個(gè)表達(dá)上調(diào)，30個(gè)表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見表2。

表2 ENCODE中47個(gè)乳腺癌差異表達(dá)的lncRNAs

Table 2. Forty-seven differentially expressed lncRNAs of breast cancer included in GENCODE

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValMNX1-AS1ENST00000480284Up-regulation7.140.014MIATENST00000613780Up-regulation5.120.019LINC00922ENST00000569736Up-regulation4.860.027LINC00487ENST00000382045Up-regulation4.420.046HOXA11-ASENST00000522674Up-regulation4.260.002H19ENST00000414790Up-regulation4.140.020ZFHX4-AS1ENST00000518143Up-regulation3.980.035LEF1-AS1ENST00000512637Up-regulation3.680.008RP11-46107.1ENST00000501259Up-regulation3.580.014RP11-690C23.2ENST00000366308Up-regulation3.140.014USP30-AS1ENST00000478808Up-regulation2.860.005CDKN2A-AS1ENST00000441769Up-regulation2.800.009CACTIN-AS1ENST00000592274Up-regulation2.380.008ZNF252P-AS1ENST00000527067Up-regulation2.360.020FBXL19-AS1ENST00000563777Up-regulation2.160.040RP11-383H13.1ENST00000518700Up-regulation2.100.007BAALC-AS2ENST00000436771Up-regulation2.020.004PROSER2-AS1ENST00000445498Down-regulation2.020.009SERTAD4-AS1ENST00000437764Down-regulation2.040.030LINC00271ENST00000421378Down-regulation2.040.021ZMIZ1-AS1ENST00000456353Down-regulation2.080.012ZNF436-AS1ENST00000335648Down-regulation2.080.024LINC00924ENST00000556053Down-regulation2.120.021ZNF667-AS1ENST00000299997Down-regulation2.120.041ARHGAP5-AS1ENST00000553596Down-regulation2.320.009BDNF-ASENST00000499008Down-regulation2.400.007STX17-AS1ENST00000529965Down-regulation2.420.021RP11-181C3.1ENST00000501499Down-regulation2.500.040MIR17HGENST00000582141Down-regulation2.600.010MIRLET7BHGENST00000360737Down-regulation2.620.028RP11-617D20.1ENST00000440181Down-regulation2.740.044ADD3-AS1ENST00000369655Down-regulation2.900.020EPB41L4A-AS1ENST00000413221Down-regulation2.960.002LINC01549ENST00000440664Down-regulation3.120.035LINC01140ENST00000490006Down-regulation3.200.044LINC00640ENST00000554409Down-regulation3.200.009

(Table 2 continues on next page) (continued from previous page)

lncRNAGene IDExpression changeFold changeadj.P.ValLINC01197ENST00000508732Down-regulation3.320.032LINC00284ENST00000592085Down-regulation3.480.024FGF14-AS2ENST00000606448Down-regulation3.700.005LINC00323ENST00000441268Down-regulation3.740.005RP11-161M6.2ENST00000563863Down-regulation3.800.015FGF13-AS1ENST00000438238Down-regulation4.280.005LINC01235ENST00000604724Down-regulation4.300.017HOXA-AS3ENST00000518947Down-regulation4.720.001LINC00908ENST00000578613Down-regulation5.380.018AC226118.1ENST00000515213Down-regulation5.620.001PGM5-AS1ENST00000417887Down-regulation6.100.010

圖1 8對(duì)乳腺腫瘤組織及其癌旁對(duì)照組織中差異表達(dá)lncRNA聚類分析圖

Figure 1. A comparison between differentially expressed lnsRNA profiles in 8 breast cancer tissue and those in 8 normal breast tissue:Hierarchical clustering

2.2 lncRNAs參與的生物信息學(xué)功能分析

采用starbase 2.0對(duì)47個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)lncRNAs靶基因進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析，以了解差異基因所具有的生物學(xué)意義以及所參與的重要生物學(xué)途徑。結(jié)果如圖2、圖3所示。通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs廣泛地參與了基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因沉默及細(xì)胞代謝等生物學(xué)進(jìn)程；通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs參與了乳腺癌、膀胱癌以及前列腺癌進(jìn)程，并參與了PI3K-Akt、Ras、TNF以及p53等信號(hào)通路。

圖2 GO富集分析乳腺癌中異常表達(dá)的lncRNAs

Figure 2. GO enrichment analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

圖3 KEGG信號(hào)通路分析乳腺癌中差異表達(dá)的lncRNAs

Figure 3. KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed lncRNAs in breast cancer

2.3 采用qRT-PCR方法驗(yàn)證lncRNAs在乳腺癌組織中的表達(dá)水平

為了明確生物信息學(xué)篩選的可靠性，分別選取乳腺癌中3個(gè)高表達(dá)(MNX1-AS1，MIAT，HOXA11-AS)和3個(gè)低表達(dá)(PGM5-AS1，LINC00908，AC226118.1)的lncRNA，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)其在50例乳腺癌病理組織和50例癌旁組織中的表達(dá)水平，采用t檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS在乳腺癌病理組中的表達(dá)水平明顯高于其癌旁非腫瘤對(duì)照組，而PGM5-AS1、LINC00908和AC226118.1在乳腺癌病理組中的表達(dá)水平低于其癌旁非腫瘤對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果如圖4。

圖4 LncRNAs在乳腺癌組織中相對(duì)于癌旁組織的表達(dá)水平

Figure 4. Comparision between relative expression levels of lncRNAs in breast cancer tissue and those in control tissue

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 評(píng)價(jià)lncRNA潛在診斷價(jià)值

為了評(píng)價(jià)lncRNA作為診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值，我們選取乳腺癌中高表達(dá)的MNX1-AS1作為研究對(duì)象，利用SigmaPlot 12.5進(jìn)行ROC曲線繪制，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.921，當(dāng)cut-off為1.425時(shí)，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。結(jié)果如圖5。

圖5 MNX1-AS1對(duì)乳腺癌的潛在診斷價(jià)值

Figure 5. Potential diagnostic value of MNX1-AS1 for breast cancer

3 討 論

LncRNA廣泛地被報(bào)道參與人類許多疾病的發(fā)生，如腫瘤[12]、自身免疫性疾病[13]、炎癥和感染[14]等。目前，lncRNA的檢測(cè)方法主要為lncRNA特異芯片[15]、tiling芯片[16]以及RNA-seq測(cè)序[17]等，然而這些方法價(jià)格不菲，且需要特殊儀器檢測(cè)。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)現(xiàn)有基因芯片進(jìn)行再分析，能夠挖掘到芯片原使用者不曾注意到的信息，從而發(fā)揮更大的效用[18-19]。通過(guò)篩選GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中含有l(wèi)ncRNA探針的芯片并重新注釋，可以得到其匹配的lncRNA的名稱，以分析lncRNA的表達(dá)情況。這種方法可以充分利用現(xiàn)有豐富的基因芯片數(shù)據(jù)資源，同時(shí)也節(jié)省了研究成本。

本研究選取乳腺癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE33447，利用基于R語(yǔ)言的Limma函數(shù)包對(duì)基因芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得每個(gè)探針的倍數(shù)變化值。根據(jù)該值，篩選差異表達(dá)的探針以獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)值。最后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)的lncRNA。通過(guò)分析基因芯片數(shù)據(jù)，共篩選出227個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中135個(gè)lncRNAs上調(diào)，92個(gè)lncRNAs下調(diào)。雖然這些lncRNA具有明確的名稱，但大部分基因功能并不十分清楚。為了確保這些lncRNAs的可靠性，采用ENCODE對(duì)篩選出的差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)一步注釋，只保留ENCODE中包含的47個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中17個(gè)表達(dá)上調(diào)，30個(gè)表達(dá)下調(diào)。

近年來(lái)，已有少量本文中所篩選出的差異表達(dá)lncRNA在乳腺癌中的報(bào)道。例如MIAT、H19、HOXA11-AS等。Luan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MIAT在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中表達(dá)增高，且MIAT 表達(dá)水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。敲除MIAT可體外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。隨后，Alipoor等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的MIAT可作為乳腺癌診斷和治療的新型腫瘤標(biāo)志物。Vennin等[22]發(fā)現(xiàn)，H19在乳腺癌中表達(dá)增高，高表達(dá)的H19可通過(guò)H19/miR-675軸調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移以及腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。Zhou等[23]研究證實(shí)，H19可通過(guò)差異海綿吸附的方式競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-200b/c和let-7b，從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程，抑制H19將降低乳腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。目前，已有較多HOXA11-AS在多種腫瘤中異常高表達(dá)的報(bào)道。例如非小細(xì)胞肺癌[24]、結(jié)直腸癌[25]、胃癌[26]及宮頸癌[27]等，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。最近，Li等[28]采用qRT-PCR的方法對(duì)50例乳腺癌組織及其癌旁組織中的HOXA11-AS進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的HOXA11-AS明顯高于癌旁對(duì)照組織。敲除HOXA11-AS可在體內(nèi)體外抑制EMT相關(guān)分子標(biāo)志物(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin)，從而抑制EMT進(jìn)程，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[28]。通過(guò)上述文獻(xiàn)報(bào)道，初步證實(shí)了采用生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)目的基因的可靠性。

為了進(jìn)一步確認(rèn)生物信息學(xué)篩選基因芯片結(jié)果的可靠性，我們選取乳腺癌中暫無(wú)報(bào)道的MNX1-AS1、PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1，以及已經(jīng)在乳腺癌中報(bào)道的MIAT，HOXA11-AS，采用qRT-PCR的方法驗(yàn)證這些lncRNA在乳腺癌中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MNX1-AS1、MIAT、HOXA11-AS表達(dá)增加；PGM5-AS1，LINC00908和AC226118.1表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了評(píng)價(jià)lncRNA作為診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值，我們對(duì)乳腺癌中高表達(dá)的MNX1-AS1繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)AUC為0.921，當(dāng)cut-off為1.425時(shí)，靈敏度和特異性分別為0.933和0.800。由此可見，通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選腫瘤相關(guān)lncRNA，在解決研究的盲目性以及節(jié)約時(shí)間和成本上起到一定的作用，也可為lncRNA與乳腺癌之間進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

綜上所述，通過(guò)生物信息學(xué)方法可為篩選腫瘤相關(guān)lncRNA提供一個(gè)方便、快捷的途徑，為尋找腫瘤新型標(biāo)志物提供了新的思路，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，分析lncRNA與乳腺癌病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素以及孕激素水平等相關(guān)性，并進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)明確lncRNA所具有的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路，為lncRNA作為乳腺癌新型生物標(biāo)志物以及臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。