王志鵬++封慧++郭茗++王長松

摘要：目的 探討薤白皂苷對血小板聚集及血小板-中性粒細胞間相互作用的影響。方法 分別于在體和離體環(huán)境下觀察SD大鼠血小板聚集功能，采用玫瑰花環(huán)試驗測定血小板與中性粒細胞的黏附能力，檢測細胞溶質(zhì)鈣離子的濃度。結果 薤白皂苷離體環(huán)境下呈濃度依賴性抑制花生四烯酸（AA）、腺苷二磷酸（ADP）或血小板活化因子（PAF）誘導的血小板聚集；薤白皂苷在體環(huán)境下呈濃度依賴性抑制PAF、ADP及AA誘導的血小板聚集，5 mg/kg薤白皂苷明顯抑制PAF、AA和ADP誘導的血小板聚集；薤白皂苷可降低洗滌血小板內(nèi)鈣離子濃度；薤白皂苷可降低中性粒細胞與凝血酶激活的血小板間的黏附，并抑制中性粒細胞上清液誘導的血小板聚集，其50%抑制濃度分別為2.7、9.6 μmol/L。結論 薤白皂苷體外和體內(nèi)均可抑制血小板聚焦，抑制血小板-中性粒細胞間的相互作用。

關鍵詞：薤白皂苷；血小板-中性粒細胞；血小板聚集

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.008

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0033-05

Effects of Saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs on Platelet Aggregation

and Interactions between Platelets and Neutrophils

WANG Zhi-peng， FENG Hui， GUO Ming， WANG Chang-song

Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University， Nanjing 210009， China

Abstract： Objective To investigate the effects of saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs （SMBB） on platelet aggregation and platelet-neutrophil-interactions. Methods The effects of SMBB on platelet aggregation in SD rats were observed in vivo and in vitro. The adhesion of platelets to neutrophils was measured by rosette test. The effect of SMBB on activated platelet calcium levels was detected. Results Platelet aggregation induced by platelet activating factor （PAF）， adenosine diphosphate （ADP） and arachidonic acid （AA） was significantly inhibited by SMBB in vitro concentration-dependent. Platelet aggregation induced by PAF， AA and ADP was significantly inhibited by 5 mg/kg of SMBB. SMBB could reduce the intracellular calcium concentration in the wash platelets. SMBB significantly reduced the adhesion between neutrophils and thrombin-activated platelets and inhibited neutrophil supernatant-induced platelet aggregation， with IC50 of 2.7 μmol/L and 9.6 μmol/L， respectively. Conclusion SMBB can inhibit platelet aggregation in vitro and ex vivo， and inhibit the interactions between platelets and neutrophils.

Keywords： saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs； platelet-neutrophil interactions； platelet aggregation

傳統(tǒng)觀點認為血小板是參與血栓形成的主要細胞，其與中性粒細胞的聯(lián)系并不十分密切。近年來，更多的研究顯示，中性粒細胞不僅參與了血小板聚集

基金項目：江蘇省中醫(yī)藥管理局資助項目（YB2015180）；南京市衛(wèi)生科技項目（YKK16281）

通訊作者：王長松，E-mail：kingidoc@126.com

與血栓形成過程，還通過釋放多種細胞因子參與心肌梗死的整個病理機制，故認為血小板和中性粒細胞的相互作用可能是冠心病及心肌梗死發(fā)生發(fā)展的關鍵因素之一[1-2]。薤白有行氣導滯、通陽散瘀的功效，是治療胸痹、真心痛的要藥，相關方劑“瓜蔞薤白白酒湯”“瓜蔞薤白半夏湯”“枳實薤白桂枝湯”是臨床常用治療胸痹、真心痛的名方。研究表明，薤白中皂苷類化合物通過抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動脈粥樣硬化的整個過程[3]，但其具體微觀機制并未解釋。本研究旨在探討薤白皂苷分別于在體和離體環(huán)境下對血小板活化因子（PAF）、腺苷二磷酸（ADP）及花生四烯酸（AA）誘導的血小板聚集的干預及對血小板-中性粒細胞間相互作用的影響。endprint

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～260 g，東南大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物許可證號SYXK（蘇）2013-0037，飼養(yǎng)于東南大學醫(yī)學院實驗動物中心SPF級實驗動物房。

1.2 藥物及制備

薤白皂苷：將新鮮薤白鱗莖（南京鶴齡藥事服務有限公司，產(chǎn)地：河南省平頂山市）搗碎，先用乙醇從中提取出薤白總皂苷，然后運用多種色譜學方法分離出已知化學結構的6種薤白皂苷的混合物[4-5]。阿司匹林片，吉林集安益盛藥業(yè)股份有限公司，批號20170407821，500 mg/片；維拉帕米片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號2017010226，120 mg/片。使用前溶解于100 mmol/L Na2CO3。

1.3 主要試劑與儀器

ADP、AA、PAF和人凝血酶，Hoffmann-La Roche Ltd；鈣離子熒光探針（Fura-2-AM）、N-甲?；琢虬滨?亮氨酰-苯基-丙氨酸（fMLP）和二甲基亞砜（DMSO），Sigma Chemical Co.。AA和PAF溶解于PBS，于100 mmol/L Na2CO3和Tris-NaCl緩沖液分別加入0.25%牛血清白蛋白，fMLP溶解在DMSO中。高速離心機（型號GL10MA），湖南凱達科學儀器有限公司；微孔板振蕩器（型號MPS40），上海達姆實業(yè)有限公司；流式細胞儀，美國BD公司；生物發(fā)光凝集測定儀，ChronoLog Corp，Havertown。

1.4 血小板制備

收集大鼠頸動脈血，用于血小板與中性粒細胞結合實驗的動脈血用2.7%乙二胺酸處理，用于抗血小板聚集實驗的動脈血用3.8%檸檬酸鈉抗凝。分別于180×g和1000×g離心10 min，得富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP），PRP再以1000×g離心10 min，然后將細胞重懸于PBS（含有1.0%牛血清白蛋白和1 mmol/L CaCl2）中洗滌，臺盼藍拒染實驗檢測細胞存活率高于95%，將細胞濃度調(diào)至108/mL。

1.5 中性粒細胞制備

從剩余血液中用葡聚糖沉淀法分離出中性粒細胞，置于Ficoll-Hy-paque細胞分離液（特異性密度1.077 g/mL）中，用低滲法去除紅細胞。將細胞沉淀重新懸浮于由155 mmol/L NH4Cl、2.96 mmol/L KHCO3和3.72 mmol/L乙酰膽堿組成的紅細胞溶解緩沖液中，將試管倒置，5 min后，將懸浮液350×g離心10 min，PBS洗滌細胞，再重懸于含1 mmol/L CaCl2的Hank's溶液中。將細胞濃度調(diào)整為2×106/mL備用。

1.6 血小板聚集

體外血小板聚集：PRP中血小板聚集率參照文獻[4]Born法進行測量。用生物發(fā)光凝集測定儀監(jiān)測最大聚集率（誘導血小板聚集濃度為ADP 3 μmol/L、AA 0.35 mmol/L、PAF 7.2 nmol/L）。計算藥物抑制血小板聚集率。血小板聚集率（%）=（A-B）÷A×100%。公式中A為添加對照物（生理鹽水）時濁度的最大變化，B為加入藥物（薤白皂苷、阿司匹林）時濁度的最大變化。50%抑制濃度（IC50）=添加抑制物值÷不添加抑制物值。

體內(nèi)血小板聚集：實驗大鼠隨機分為生理鹽水組、阿司匹林組和薤白皂苷組，每組6只，分別給予相應溶液2 mL灌胃，PRP和PPP分別在給藥前和給藥后60、120、180、240 min制備。用生物發(fā)光凝集測定儀監(jiān)測ADP、AA或PAF誘導的血小板最大聚集率。

1.7 細胞溶質(zhì)鈣離子濃度測定

取上述血小板混懸液200 μL裝入試管，加Fluo-3使其終濃度為4 μmol/L，37 ℃孵育30 min，再加PBS稀釋50倍，流式細胞儀檢測10 000個血小板的熒光強度。在1 mmol/L CaCl2條件下加Triton X-100測定最大熒光值Fmax，加入20 mmol/L鈣離子螯合劑測定最小熒光值Fmin，分別加入1 mL AA（200 μmol/L），37 ℃孵育10 min，再加入0.5%DMSO、阿司匹林及0.16、0.8、4、20、100 μmol/L薤白皂苷，測定熒光值F。計算細胞內(nèi)Ca2+濃度[Kd（F-Fmin）÷（Fmax-F）]，其中Kd為解離常數(shù)450 nmol/L[6]。

1.8 玫瑰花環(huán)試驗

將上述血小板懸浮液50 μL等分置于微量滴定孔中，加入（不攪拌）1.2 U/mL人凝血酶10 μL（終濃度為0.2 U/mL），靜置15 min，再加入50 μL 2%多聚甲醛固定血小板，靜置30 min，在凝血酶活化前加入0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液50 μL。PBS洗滌胰蛋白酶3次并重懸于50 μL PBS中。然后向血小板懸浮液中加100 μL中性粒細胞，4 ℃搖擺孵育30 min。將攜帶2個或更多血小板的中性粒細胞定義為玫瑰花環(huán)。隨即尋找不重復視野評價100個中性粒細胞。每個標本分3份進行測試，2個不同的觀察者評估玫瑰花環(huán)百分比并取平均值[7]。

1.9 檢測中性粒細胞上清液誘導的血小板聚集

將fMLP（2 μmol/L）加中性粒細胞懸液37 ℃孵育10 min，3000×g離心1 min，獲得活化的中性粒細胞上清液。將洗滌的血小板與0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液孵育10 min，37 ℃加入5 μL無活性的中性粒細胞上清液。按“1.6”項下方法測定。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 薤白皂苷對體外血小板聚集的影響endprint

薤白皂苷呈濃度依賴性明顯抑制AA誘導的血小板聚集，IC50為2.4 μmol/L。對ADP或PAF誘導的血小板聚集，薤白皂苷也有顯著影響，IC50值分別為0.4、1.1 μmol/L；阿司匹林濃度依賴性地抑制AA誘導的血小板聚集（IC50為6.3 μmol/L），而不抑制ADP或PAF誘導的血小板聚集。結果見表1。

2.2 薤白皂苷對體內(nèi)血小板聚集的影響

與生理鹽水組比較，給藥后60、120、180 min，薤白皂苷和阿司匹林對AA誘導血小板聚集均有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），薤白皂苷對ADP（給藥后60、120、180 min）和PAF（給藥后60、120 min）引起的血小板聚集有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但阿司匹林對ADP和PAF引起的血小板聚集無明顯影響。結果見表2。

2.3 薤白皂苷對血小板胞漿鈣離子水平的影響

AA刺激生理鹽水干預血小板內(nèi)游離[Ca2+]i的Fluo-3熒光強度流式細胞儀檢測結果見圖1、圖2，100 μmol/L薤白皂苷干預血小板[Ca2+]i的Fluo-3熒光強度流式細胞儀檢測結果見圖3、圖4。薤白皂苷呈濃度依賴降低血小板內(nèi)游離[Ca2+]i，20、100 μmol/L薤白皂苷干預血小板內(nèi)游離[Ca2+]i濃度顯著低于AA刺激生理鹽水干預血小板內(nèi)游離[Ca2+]i濃度（P<0.05）。結果見表3。

2.4 薤白皂苷對血小板和中性粒細胞間結合的影響

薤白皂苷抑制血小板和中性粒細胞結合的玫瑰花環(huán)率呈濃度依賴性，見表3。薤白皂苷和阿司匹林明顯降低IC50，分別為2.7、25.6 μmol/L的血小板與中性粒細胞的結合。

2.5 薤白皂苷對活化中性粒細胞上清液誘導血小板聚集的影響

薤白皂苷顯著抑制由fMLP激活的中性粒細胞誘導洗滌的血小板聚集，見表3。IC50為9.6 μmol/L，阿司匹林對fMLP激活的中性粒細胞誘導的血小板聚集無抑制作用。

3 討論

薤白中皂苷類化合物通過抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動脈粥樣硬化的整個過程。PAF、ADP和AA可引起血小板活化，并通過不同的途徑導致血小板聚集[8]。本研究結果顯示，薤白皂苷體外以濃度依賴方式抑制PAF、ADP和AA誘導的血小板聚集，給藥后60、120 min，薤白皂苷和阿司匹林對AA誘導的血小板聚集均有明顯的抑制作用，薤白皂苷也分別在給藥后60、120、180 min和60、120 min對ADP或PAF誘導的血小板聚集有明顯的抑制作用。有研究報道，血小板功能亢進與血栓形成障礙相關[9]。而本研究表明，薤白皂苷對血小板聚集的抑制是非特異性的，可能對血栓形成過程有多靶點的抑制作用。

血小板凝血酶活化后，血小板選擇受體會迅速表達到細胞表面，并介導活化血小板與中性粒細胞的結合與黏附[10]。有研究報道，阿司匹林不抑制血小板選擇受體的表達，而會明顯抑制ADP刺激下的血小板釋放致密顆粒[11]。本研究結果顯示，阿司匹林可抑制血小板與中性粒細胞黏附，其機制可能為阿司匹林影響血小板表面其他黏附分子的繼發(fā)表達，降低血小板與中性粒細胞黏附。本研究結果顯示，薤白皂苷可顯著抑制血小板與中性粒細胞的結合，其IC50與阿司匹林相當。研究發(fā)現(xiàn)，激活的血小板可增加中性粒細胞對外來信號的黏附，中性粒細胞聚集，溶酶體酶釋放，血小板衍生產(chǎn)物能促進中性粒細胞趨化性、酶的釋放和吞噬作用并抑制氧化爆發(fā)[12]。另一方面，血小板與中性粒細胞的黏附參與血栓調(diào)節(jié)過程，中性粒細胞衍生的產(chǎn)物可促進血小板聚集和血清素釋放，血栓形成也是由血小板-中性粒細胞相互作用介導[13]。臨床研究顯示，血栓形成性疾病患者血小板新生蓮花瓣數(shù)目明顯增加[11]。本研究結果表明，薤白皂苷能明顯抑制活化血小板與中性粒細胞結合的能力，可能有助于治療血栓栓塞性疾病。

活化的中性粒細胞上清液含有大量生物活性物質(zhì)，可影響血小板聚集、血栓形成和細胞內(nèi)外Ca2+的運動[14]。本研究結果顯示，阿司匹林對活化的中性粒細胞刺激的血小板聚集無影響，表明環(huán)氧合酶可能不直接參與中性粒細胞誘導的血小板聚集。有研究發(fā)現(xiàn)，毒性氧自由基、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和PAF是中性粒細胞依賴性血小板激活的介質(zhì)[10]。薤白皂苷對來自fMLP激活的中性粒細胞無細胞上清液誘導的血小板聚集呈濃度依賴性抑制，故薤白皂苷可能通過多個途徑抑制血小板-嗜中性粒細胞相互作用。

血小板內(nèi)[Ca2+]i的升高是血小板受外界不良刺激后受累范圍的第二信使，在血小板形狀發(fā)生變化、粘連、聚集時首先出現(xiàn)血小板內(nèi)鈣離子升高，[Ca2+]i又是血小板活化和血小板-中性粒細胞相互作用的重要介質(zhì)[15]。本研究結果顯示，AA誘導血小板內(nèi)[Ca2+]i遠高于正常水平，即血小板處于明顯活化狀態(tài)，薤白皂苷濃度依賴性地降低AA刺激的血小板[Ca2+]i。表明薤白皂苷抑制細胞外鈣的流入和來自細胞外鈣的流出。減少細胞溶質(zhì)鈣是薤白皂苷抑制血小板聚集和血小板和中性粒細胞間相互作用的機制之一。

綜上，薤白皂苷體外和體內(nèi)均可抑制血小板聚集，降低血小板-中性粒細胞黏附，并抑制活化的中性粒細胞誘導的血小板聚集。由于其抗血小板作用和抑制血小板-中性粒細胞相互作用，可能為開發(fā)血小板聚集類藥物提供實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-07-11）

（修回日期：2017-07-25；編輯：華強）endprint