黃海峰

【摘 要】觀察原花青素對反復力竭運動后大鼠腓腸肌自由基代謝和細胞凋亡相關蛋白TNF-a、Fas、caspase-8表達的影響。方法：建立大鼠反復力竭動物模型及原花青素藥物模型，雄性SD大鼠40只，隨機分為4組，即安靜組（C）、給藥組（M）、力竭組（E）、給藥+力竭組（ME），E組、ME組均進行四周的反復力竭跑臺訓練。檢測力竭運動后各組大鼠骨骼肌線粒體丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）氧自由基損傷相關指標的變化，TUNEL法檢測腓腸肌凋亡，免疫組化技術(shù)檢測腓腸肌組織中TNF-a、Fas、caspase-8蛋白水平差異表達；Real-time PCR技術(shù)檢測TNF-a、Fas、caspase-8mRNA表達水平。

【關鍵詞】原花青素；大鼠；力竭運動；骨骼??；凋亡蛋白

運動疲勞導致骨骼肌損傷是運動訓練中常見的運動性疾病，其發(fā)生機制主要是訓練時肌肉負荷過大，超過機體的承受能力，長期運動訓練后肌肉生理機能未能得到充分恢復，導致運動與恢復動態(tài)平衡的失衡。研究運動疲勞致肌肉損傷的病理機制及防治措施，對我們預防運動訓練損傷、提高訓練及比賽成績以及在運動健身和功能恢復等領域，具有十分重要的意義。

本文通過研究運動過程中骨骼肌生化、酶學及相關蛋白基因表達等方面的變化，探討骨骼肌細胞凋亡及壞死發(fā)生的可能機制進行初步探討，并揭示原花青素對反復力竭運動后對大鼠骨骼肌的保護機制，為今后其在運動領域上的應用提供更一定的理論支持。以期為運動損傷的預防及治療的措施提供理論依據(jù)。

一、研究對象與方法

（一）研究對象

健康SD大鼠40只，雄性，體重210g-250g，室溫控制在20-25℃，自由飲食，每籠10只，適應性喂養(yǎng)3天。

（二）研究方法

1.分組

將大鼠隨機分成4組，即安靜組（C）、給藥組（M）、力竭組（E）、給藥+力竭組（ME），每組10只。

2.給藥方案純度為95%的原花青素（購自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司），配制成10mg/mL的原花青素水溶液，以15mL/（kg·d）對M組和ME組大鼠灌胃給藥，C組和E組按其體重灌胃15mL/（kg·d）生理鹽水。每日晨起稱重，根據(jù)體重變化，計算給藥量。

3.運動方案

參考Bedford（1979）所建立的漸增負荷運動模型（下坡跑），第一級負荷：00，8.2m/min，15min（相當于53%V02max）；第二級負荷：50，15m/min，15min（相當于64%VO2max）；第三級負荷：100，19.3m/min （相當于76%VO2max），持續(xù)運動至大鼠力竭。E組和ME組大鼠，每周運動6天，休息一天，連續(xù)運動6周。運動中使用光、電、聲刺激維持運動強度。力竭標準：大鼠跑姿由蹬地式變?yōu)榉厥剑瑴粼谂艿蓝瞬荒芾^續(xù)跑動，給予聲波和光刺激均不能驅(qū)使大鼠繼續(xù)維持跑動。

4.取材

末次運動24h后，用10%的水合氯醛麻醉（0.3ml/100 g 體重），使用滅菌鑷子以摘眼球的方式取血，收集血液于10 ml 離心管中， 4℃、6000r/min 離心 10 min，小心吸取上層血清500 μl，用離心管分裝并冷凍保存于-20℃。取出腓腸肌組織，部分腓腸肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，放入4℃冰箱存儲備用，剩余部分肌肉組織保存于超低溫冰箱（-80℃）中備用。

5.細胞凋亡的檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法 （terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling，TUNEL ）進行細胞凋亡檢測，TUNEL試劑盒購自于美國Promega公司。在普通光學顯微鏡下觀察，陽性凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色或棕褐色著染。光學顯微鏡（×400）下每張切片隨機觀察6個視野，每個視野至少 100 個細胞核水平。以 Simple PCI 顯微圖像分析軟件測試每100個細胞中的平均陽性凋亡細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index ，AI）。

6.腓腸肌組織SOD檢測

7.腓腸肌組織MDA檢測

8.腓腸肌組織蛋白印跡檢測

腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8蛋白測定：采用Western免疫印跡檢測。各細胞因子蛋白測試時分別取腓腸肌100mg加入組織裂解液勻漿，后離心（16000/min，30min）取上清，標定蛋白濃度上樣后，經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加一抗4℃過夜。TBST液沖洗，加堿性磷酸酶標記的二抗1：3000稀釋液孵育，NBT/BCIP顯色，以各細胞因子與Beta-Actin的比值作為相對表達量。

9.R-T PCR檢測

（1）總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄

總mRNA提?。翰捎脛游锝M織RNAprep Pure Tissue Kit試劑盒，購自于天根生化科技（北京）有限公司；酸濃度測定儀（Eppendorf 德國）測定提取的總RNA濃度及吸光度值（A），均測得A值 1.9 < A260/A280 < 2.0 再行下一步實驗 ；瓊脂糖凝膠電泳顯示 28 S、18 S、5 S 三條電泳條帶，表明所提取的總RNA無降解，可作為逆轉(zhuǎn)錄反應的模板。

mRNA的逆轉(zhuǎn)錄：準備20ul的反應體系，42℃反應60min。70℃熱處理5min，加水稀釋至100ul，-20℃保存或者做后續(xù)實驗。

（2）Real-time PCR

儀器：ABI 7900HT，（ABI公司）試劑：SYBR R Premix Ex Taq TM（Takara）試劑盒。根據(jù)Gene Bank核酸數(shù)據(jù)庫中血管各因子cDNA序列，F(xiàn)as、caspase-8基因引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設計合成，引物均購于上海生工公司。引物合成序列如下：

TNF-a-A： 5- CAT GGA TCTCAAAGACAACAAA-3；TNF-a-B： 5-CTCCTGGTATGAAATGGCAAAT-3；

Fas-A： 5-AGCTCCTTTGGCTGCTGATCCTC-3；Fas-B： 5-CGTGAGATTGATACCAGCACTG-3；

Caspase-8-A，5-TGCCCTCAAGTTCCTGTGCTT-3；Caspase-8-B，5-TTCCTCCAACATCCCCTCTTC-3；

GAPDH-A：5-ATGACCACAGTCCATGCCATCAC-3；GAPDH-B：5-CACCTTCTTGATGTCATCATACTTG-3

（三）統(tǒng)計學分析

采用中文SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，并采用SigmaPlot10.0軟件作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計以平均數(shù)±標準差（±s）來表示，組間對比分析采用單因素方差分析方法，采用雙側(cè)t檢驗進行兩兩比較，若P﹤0.05表示為具有顯著統(tǒng)計學意義，若P﹤0.01表示為具有非常顯著統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

（一）各組大鼠腓腸肌細胞凋亡率

表1顯示：各組大鼠腓腸肌細胞凋亡率分別為：C組為1.54%、M組為1.35%、E組15.73%、ME組為3.26%。C組和M組相比沒有顯著性差異（P﹥0.05），但E組、ME組細胞凋亡率與C組有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與M組相比，E組、ME組細胞凋亡率有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與E組的抑制率相比，ME組細胞凋亡率有非常顯著性差異（P﹤0.01）。

（二）各組大鼠腓腸肌細胞內(nèi)SOD、MDA活性

表2顯示：大鼠腓腸肌細胞內(nèi)SOD活性，C組與M組以及ME組相比有顯著性差異（P﹤0.05），C組與E組相比有非常顯著性差異 （P﹤0.01）。與M組相比，E組、ME組細胞SOD活性有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與E組腓腸肌SOD活性相比，ME組有非常顯著性差異（P﹤0.01）。大鼠腓腸肌細胞內(nèi)MDA活性，C組與M組相比沒有有顯著性差異（P﹥0.05），C組與E組相比有非常顯著性差異 （P﹤0.01），C組與ME組相比有顯著性差異 （P﹤0.05）。與M組相比，E組組腓腸肌細胞MDA活性有非常顯著性差異（P﹤0.01），ME組組MDA活性有顯著性差異（P﹤0.05）。與E組腓腸肌MDA活性相比，ME組細胞有非常顯著性差異（P﹤0.01）。

（三）各組大鼠腓腸肌組織TNF-a、Fas、caspase-8m RNA表達檢測結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示：TNF-a、Fas、caspase-8 mRNA的表達：與C組相比，E組存在顯著性差異（P<0.01），M組、ME組不具有差異性（P﹥0.05）；與M組相比，E組存在顯著性差異（P<0.01），ME組不具有差異性（P﹥0.05）；與E組相比，ME組存在顯著性差異（P<0.01）。

（四）各組大鼠腓腸肌組織TNF-a、Fas、caspase-8蛋白檢測結(jié)果

由表3和圖1可以看出，E組TNF-a、Fas、caspase-8蛋白明顯高于其他各組（P<0.01），C組和M組相比沒有顯著性差異（P﹥0.05）。TNF-a蛋白表達與M組相比，ME組有顯著性差異（P﹤0.05）。Fas蛋白表達與C組相比，ME組有顯著性差異（P﹤0.05）。

三、討論

（一）骨骼肌細胞凋亡的檢測

Podhorska-Okolow等的研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)運動的小鼠在進行一夜輪形籠自發(fā)跑步后，凋亡肌細胞明顯高于對照組，在4d后減少。Boffi等以純種馬為研究對象，對其進行3個月跑臺訓練，跑臺運動結(jié)束后采用原位末端標記法（TUNEL）和DNA瓊脂糖凝膠電泳的研究后發(fā)現(xiàn)，運動訓練組的肌細胞凋亡數(shù)量明顯增多，推測訓練導致體能增長的原因在于新生細胞不斷代替凋亡的異常肌細胞。王長青等以大鼠為研究對象，對大鼠進行了為期1d，6d，12d和18d的運動訓練，運動訓練結(jié)束后40min取材，用流式細胞技術(shù)和TUNEL法檢測骨骼肌細胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)運動訓練可使骨骼肌細胞凋亡的比例增加，骨骼肌細胞凋亡的比例增加明顯高于對照組，其中以訓練6d組骨骼肌細胞凋亡的比例最高。羅吉偉，透射電鏡觀察SD大鼠研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周反復力竭運動后大鼠骨骼肌肌絲排列紊亂等壞死表現(xiàn)，核固縮等凋亡表現(xiàn)，線粒體腫脹和空泡變性等異常表現(xiàn)，且流式細胞儀檢查發(fā)現(xiàn)各運動組大鼠腓腸肌細胞凋亡和壞死增多。宋衛(wèi)紅等人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠在跑臺，經(jīng)過3d重復性力竭運動后，骨骼肌細胞核發(fā)生了凋亡，其凋亡指數(shù)在運動后即刻明顯升高，運動后24h達到峰值。

本實驗結(jié)果表明，SD大鼠經(jīng)過6周反復力竭運動后，骨腓腸肌細胞發(fā)生了凋亡，與安靜組（C）組相比，有顯著的差異。ME組細胞凋亡率高于C組和M組，但與E組相比，已經(jīng)有明顯降低。這表明，原花青素對反復力竭運動過程中大鼠腓腸肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用。

（二）原花青素對反復力竭運動后大鼠腓腸肌自由基代謝的調(diào)節(jié)作用

研究表明反復力竭運動后，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而它的大量堆積會介導和損傷正常的組織細胞，如細胞膜脂質(zhì)過氧化、Ca離子超載等。自由基特點：活潑性高和氧化性極強，能通過氧化作用攻擊體內(nèi)的生物大分子物質(zhì)，使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、糖類等發(fā)生過氧化變性、交聯(lián)和斷裂，從而破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能。生物膜是由各種蛋白質(zhì)和脂類構(gòu)成，生物膜上存在各種不飽和脂肪酸，這就很容易使得生物膜成為自由基的攻擊對象，并伴隨有分解產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生。

實驗結(jié)果看出，大鼠反復力竭運動，E組和ME組腓腸肌丙二醛（MDA）含量都顯著增高，此結(jié)果與之前的研究報道相一致，說明反復力竭運動后活性氧的大量產(chǎn)生會導致細胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，雖說ME組（MDA）含量水平增高，但是與E組相比，ME組升高水平低了很多。實驗發(fā)現(xiàn)大鼠反復力竭運動過后腓腸肌超氧化物歧化酶（SOD）活性成下降趨勢，與安靜組相比具有顯著性差異。雖然ME組腓腸肌SOD含量顯著降低，但ME組腓腸肌SOD的活性顯著高于E組。這說明反復力竭運動會導致活性氧過量的產(chǎn)生和堆積從而限制了抗氧化酶的活性，還可以說明原花青素一定程度上具有提高SOD活性的能力，進而抑制MDA活性，從而達到抗肌纖維活性氧損傷和維持細胞完整性的作用。

（三）原花青素對反復力竭運動后大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、

caspase-8因子的影響

TNF-a、Fas蛋白、及死亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）屬于凋亡調(diào)控因子。腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員的跨膜蛋白受體，通過與相關配體結(jié)合發(fā)生寡聚化及結(jié)構(gòu)的改變，暴露出能與銜接蛋白結(jié)合的DD，聚集并激活銜接蛋白，引發(fā)下游caspase-8的活化。Fas，即CD95分子，屬于Ⅰ型膜蛋白。Fas主要以膜受體形式存在，在細胞凋亡中具有信號轉(zhuǎn)導作用。FasL屬于細胞表面的一種Ⅱ型膜蛋白。FasL可與Fas結(jié)合，最終會引起胞質(zhì)內(nèi)前半胱胺酸天冬酶8（Procaspase-8）分子激活，而后激活的caspase-8進一步自我激活啟動下游的Caspase相關蛋白酶級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。另一方面激活的Caspase-8也可將位于胞漿的Bid切割成截斷的Bid（tBid），tBid有很強的促凋亡活性，再次作用于線粒體釋放Cytc，通過Caspase-9/3發(fā)揮促凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，一次性大負荷運動后會引起大鼠腓腸肌細胞TNF-α、FAS蛋白表達顯著升高。鄔卓文，研究發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)過22d力竭游泳運動后會導致血清TNF-α的升高。姜振等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過急性力竭運動后，F(xiàn)as的mRNA水平明顯增高。陳筱春研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周跑臺后大鼠Caspase-8水平明顯升高。大負荷、一次性力竭或是反復力竭運動后TNF-a、Fas、caspase-8因子的表達水平異常升高，這與本研究結(jié)果一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)，通過大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達面積和mRNA的水平比較，發(fā)現(xiàn)E組合ME組大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平都明顯高于安靜組和M組。C組TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平，雖然高于M組但組間不具有差異性。E組TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平，顯著高于ME組。結(jié)果表明，長期反復的力竭運動使得TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA在大鼠腓腸肌內(nèi)過量表達，同時ME組的TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA較M組低得多，可以推測原花青素對長期反復力竭運動導致的大鼠腓腸肌內(nèi)TNF-a、Fas、caspase-8因子具有抑制性作用。

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