王艷非，常晶，高云，侯原平，孫倩美

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院綜合科，北京 100020)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是幾乎所有進(jìn)行性腎臟病發(fā)展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的最終特征[1]，RIF的主要病理特征包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚、腎小管萎縮、成纖維細(xì)胞增殖等。然而，RIF的機(jī)制仍不十分清楚，現(xiàn)有的治療方法有限且療效欠佳，因此，為了研究這種疾病的病理生理學(xué)機(jī)制、開(kāi)發(fā)與評(píng)估新的治療方法，需要建立RIF動(dòng)物模型[2]。目前關(guān)于RIF的誘導(dǎo)方法主要有手術(shù)誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)以及輻射腎病、基因突變腎病等其他動(dòng)物模型建立方法。本文對(duì)目前常用的RIF動(dòng)物模型作一綜述，以期為開(kāi)展基礎(chǔ)研究奠定試驗(yàn)方法。

1 手術(shù)誘導(dǎo)模型

1.1 單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型

單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)被認(rèn)為是研究RIF機(jī)制使用最廣泛的模型。在20世紀(jì)70年代，兔的UUO被證明會(huì)導(dǎo)致腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖并轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞。隨后UUO動(dòng)物模型逐漸被擴(kuò)展和提煉，用以闡明梗阻性腎病以及解釋腎纖維化的發(fā)病機(jī)制[3]。大多數(shù)的腎臟細(xì)胞改變發(fā)生在術(shù)后2～3周，如上皮管狀細(xì)胞損傷等，隨后腎纖維化指標(biāo)顯著增加，如由巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。這些細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)等，在UUO之后引發(fā)腎臟的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積和細(xì)胞凋亡等。其中最引人注目的是TGF-β1，其表達(dá)上調(diào)被證明發(fā)生在動(dòng)物和人類(lèi)的幾乎所有類(lèi)型的纖維性腎臟疾病中[4]。

目前大多數(shù)研究均采用UUO模型來(lái)評(píng)價(jià)RIF的治療效果。用于實(shí)現(xiàn)UUO動(dòng)物模型的手術(shù)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，一般來(lái)說(shuō)，這種模型的改變?cè)谛∈笾薪⑿枰? d，在大鼠中建立需要2～3周[3]。UUO是目前研究RIF的理想模型，文獻(xiàn)報(bào)道較多，成功率高，對(duì)動(dòng)物損傷小、死亡率低。該方法簡(jiǎn)便，病變均一，有較好的重復(fù)性。然而大鼠UUO屬于急性機(jī)械性損傷，不能適應(yīng)腎小管和間質(zhì)損傷及其纖維化的所有情況，但是該方法能夠在短期內(nèi)造成纖維化，就研究RIF的發(fā)病規(guī)律及機(jī)制探討而言，是一種較為快速、可靠的動(dòng)物模型[2]。

1.2 腎大部切除動(dòng)物模型

經(jīng)常用5/6腎切除(subtotal nephrectomy，STN)模型來(lái)評(píng)估慢性腎功能衰竭進(jìn)展的變化即腎纖維化[5]。對(duì)于腎臟疾病的研究，可以通過(guò)兩種方式：(1)單側(cè)腎切除術(shù)+剩余腎臟的切除手術(shù)，從而導(dǎo)致大約5/6腎組織減少；(2)單側(cè)腎切除術(shù)+對(duì)側(cè)腎動(dòng)脈的2個(gè)分支的完整結(jié)扎，總共產(chǎn)生5/6腎組織減少[6]。在STN模型中，殘余的腎單位增加其過(guò)濾率以保持排泄功能，當(dāng)殘余的腎單位不能完成這種排泄功能時(shí)就會(huì)發(fā)生腎功能不全。隨著時(shí)間的推移，這些動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)系統(tǒng)綜合征、蛋白尿及基質(zhì)擴(kuò)張等，12周后在最初健康的殘余腎單位中出現(xiàn)了進(jìn)行性腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[7]。

此模型是研究慢性腎臟病特異性機(jī)制的優(yōu)秀模型，并為評(píng)估潛在的新療法提供了可能。然而，這種模型是受限的，原因是手術(shù)困難和動(dòng)物死亡率較高，且大量腎組織突然喪失在人類(lèi)疾病中很少發(fā)生[2]。

1.3 缺血-再灌注動(dòng)物模型

缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IR)是一種急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)。AKI是一個(gè)嚴(yán)重的臨床問(wèn)題，可導(dǎo)致高死亡率、ESRD的發(fā)生[8]。在IR過(guò)程中，可發(fā)生一系列的事件，如腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死、活性氧代謝產(chǎn)物的積累、鈣超載以及炎癥介質(zhì)和能量代謝障礙等，會(huì)導(dǎo)致腎功能紊亂，從而導(dǎo)致代謝異常[9]。Takada等[10]證明，在腎缺血后的20～40周內(nèi)發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化主要是腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。

2 化學(xué)誘導(dǎo)模型

2.1 阿霉素腎病模型

阿霉素是一種抗腫瘤藥物，腎功能的進(jìn)行性喪失是阿霉素腎病模型的主要特點(diǎn)之一。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，多數(shù)大鼠腎臟對(duì)阿霉素?fù)p傷十分敏感，注射后可引起蛋白尿、腎小球和足細(xì)胞損傷，然后是腎小管萎縮，最后是腎纖維化。Wang等[11]對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，第5天出現(xiàn)蛋白尿，第7天蛋白尿水平較高，1～2周后觀察到腎小球出現(xiàn)顯著的透明沉積物和腎小管細(xì)胞吸收液灶狀增加，到第4周，這些變化更加明顯。第6周后，觀察到腎臟炎癥，以及嚴(yán)重的腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。阿霉素腎病模型對(duì)于闡明慢性腎臟病的腎小球、腎間質(zhì)炎癥及纖維化的病理機(jī)制很有幫助。

2.2 環(huán)孢素A腎病模型

環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)是一種主要的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，其作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床，用以改善器官移植患者的預(yù)后。然而，長(zhǎng)時(shí)間使用CsA會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化。因此，CsA的臨床應(yīng)用在一定程度上受到其腎毒性效應(yīng)的限制。1990年Rosen等[12]用皮下注射CsA的方法建立了一種可重復(fù)性大鼠鈉耗竭慢性腎毒性動(dòng)物模型，其病理表現(xiàn)類(lèi)似于長(zhǎng)期接受CsA治療者的腎臟纖維化。我國(guó)學(xué)者喬保平等[13]建立的口服劑型CsA慢性腎毒性模型，證明了低鹽飲食下，給予CsA的大鼠可出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化，說(shuō)明鈉耗竭是建立CsA慢性腎毒性模型的重要條件。然而，這種模型的缺點(diǎn)在于：高成本、肝毒性、廣泛的試驗(yàn)期以及在動(dòng)物研究中常用的CsA的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床實(shí)踐[14]。

2.3 馬兜鈴酸腎病模型

含馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)的中草藥可以引起腎臟損害，早期表現(xiàn)為出現(xiàn)腎小管損害，上皮細(xì)胞變性、壞死，以后進(jìn)展成灶狀、多灶狀直至融合成大片的寡細(xì)胞性RIF。Jadot等[15]通過(guò)對(duì)C57Bl/6J雄性小鼠腹腔內(nèi)注射AA(3.5 mg/kg)建立動(dòng)物模型，證明了AA腎病是一種從早期階段的AKI逐漸進(jìn)展至慢性腎臟病的小管間質(zhì)性疾病。我們最近的研究也表明[16]，AA可以引起腎小管萎縮、腎間質(zhì)多灶性纖維化等病理變化。文獻(xiàn)報(bào)道[17]，AA腎病最顯著的特征為廣泛的間質(zhì)纖維化。

3 新方法誘導(dǎo)模型

手術(shù)誘導(dǎo)及化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型的研究已經(jīng)逐漸成熟，然而，為了進(jìn)一步研究腎纖維化的病理生理學(xué)機(jī)制，并開(kāi)發(fā)與評(píng)估新的治療方法，有學(xué)者嘗試提出新的動(dòng)物模型。

3.1 基因突變腎病模型

目前發(fā)現(xiàn)了一種新型腎纖維化動(dòng)物模型——尿調(diào)節(jié)素相關(guān)腎病模型，其屬于常染色體顯性遺傳性間質(zhì)性腎病，以高尿酸血癥、痛風(fēng)、慢性進(jìn)展性腎間質(zhì)損害為主要臨床表現(xiàn)，最終導(dǎo)致ESRD，病因是編碼尿調(diào)節(jié)素(Tamm-Horsfall蛋白)的UMOD基因突變[18]。人UMOD基因定位于16號(hào)染色體12.3區(qū)域(16p12.3)，由640個(gè)氨基酸組成，富含半胱氨酸殘基，半胱氨酸在維持蛋白正常三維結(jié)構(gòu)及功能上非常重要[19]。UMOD基因共有11個(gè)外顯子，目前有超過(guò)60個(gè)致病突變已被確定，幾乎全部是錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)大多數(shù)位于4、5、8號(hào)外顯子，外顯子4突變最為常見(jiàn)?；蛲蛔兒?，異常的尿調(diào)節(jié)素沉積在腎小管髓袢升支粗段細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致尿調(diào)節(jié)素正常功能喪失、腎小管細(xì)胞凋亡加速及緩慢進(jìn)展的腎衰竭。Bernascone等[20]報(bào)道的尿調(diào)節(jié)素相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型顯示出特定的腎小管間質(zhì)損傷、尿液濃縮障礙及進(jìn)行性的腎衰竭；該模型是由UMOD基因的C147W突變所致，并且這些變化與人類(lèi)有非常相似的臨床特征。目前研究UMOD基因致病突變的學(xué)者越來(lái)越多，Piret等[21]在2017年也報(bào)道了由于基因突變所致的尿調(diào)節(jié)素相關(guān)腎病動(dòng)物模型，這種新的RIF小鼠模型將會(huì)成為研究連接尿調(diào)節(jié)素突變與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腎纖維化機(jī)制的寶貴資源。

3.2 先天性腎纖維化模型

Yasuda等[22]發(fā)現(xiàn)了一種由于腎單位數(shù)量減少導(dǎo)致的腎纖維化動(dòng)物模型，這種模型不同于STNx模型，是一種由于先天性腎單位數(shù)量減少最終進(jìn)展為終末期腎病的大鼠模型。腎臟發(fā)育不全(hypoplastic kidney，HPK)大鼠僅具有正常腎單位數(shù)量的20%并且表現(xiàn)出進(jìn)行性慢性腎臟病。此研究使用免疫組織學(xué)方法評(píng)估了雄性HPK大鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制，結(jié)果表明，HPK大鼠在 35 d 時(shí)顯示出腎小球肥大，TGF-β、膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)增加，所有這些改變隨著年齡增加逐漸惡化。這項(xiàng)研究清楚地表明，只有20%腎單位的先天性慢性腎臟病大鼠可導(dǎo)致腎纖維化。然而，目前還沒(méi)有很好地建立先天性腎單位的數(shù)量與腎纖維化發(fā)生的關(guān)系。

3.3 輻射腎病模型

輻射腎病是以進(jìn)行性腎小球硬化和管狀間質(zhì)纖維化為特征的慢性輻射損傷，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[23]。研究表明，在照射后24周，腎小球和管狀纖維發(fā)生了顯著的變化[24]。輻射腎病導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和慢性進(jìn)行性硬化與不同程度的腎小管間質(zhì)纖維化。在SD大鼠中，放射線(12 Gy)會(huì)導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率下降，在后期，損傷涉及腎小球、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化和輕度間質(zhì)炎癥。除了TGF-β和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)可能參與此過(guò)程外，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)無(wú)疑是這一過(guò)程的主要中介[25]，AngⅡ損傷腎小球上皮細(xì)胞，導(dǎo)致局部和全身炎癥反應(yīng)，且具有引起細(xì)胞纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、激活活性氧等作用[26]。

3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1)缺乏的c57BL/6(突變)小鼠，選擇性替代了lacZ基因的AT1a位點(diǎn)。這些動(dòng)物使我們能夠闡明AT1a介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎臟疾病特別是腎小管間質(zhì)損傷中的病理生理學(xué)機(jī)制。因此，c57BL/6(突變)小鼠在研究AT1a受體的特定功能方面具有一定作用[2]。此外，還有學(xué)者研究了ET-1轉(zhuǎn)基因小鼠腎纖維化動(dòng)物模型、綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠腎纖維化動(dòng)物模型等。

3.5 新型腺嘌呤腎病模型

自從報(bào)道腺嘌呤能夠?qū)δI功能造成影響以來(lái)，陸續(xù)有多名學(xué)者已經(jīng)成功制備出腺嘌呤引起的腎纖維化模型。接受腺嘌呤灌胃的大鼠表現(xiàn)出腎小管部分破壞、萎縮，部分?jǐn)U張，間質(zhì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，其中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞增生和間質(zhì)纖維化。然而，傳統(tǒng)的腺嘌呤灌胃法大多歷時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物死亡率高，且因動(dòng)物對(duì)腺嘌呤的反應(yīng)存在個(gè)體差異可造成模型制備不均衡等，這些缺點(diǎn)限制了其在研究中的應(yīng)用。Zhu等[27]為了彌補(bǔ)這種缺陷，建立了一種短期腺嘌呤灌胃法，在為期10 d的灌胃中，大鼠顯示出明顯的RIF特征，這種方法對(duì)動(dòng)物的損傷小，試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)藥物的個(gè)體差異小，死亡率低。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，RIF動(dòng)物模型建立方法包括手術(shù)誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)、基因突變腎病、先天性模型等。RIF動(dòng)物模型的建立為研究疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療措施提供了可能。人類(lèi)最常見(jiàn)的病理生理變化已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到了成功復(fù)制，這使我們對(duì)人類(lèi)病理學(xué)的理解變得更加深刻，我們可以開(kāi)發(fā)新的動(dòng)物模型，并評(píng)估新的治療方法。然而，沒(méi)有一種模型能完全模擬腎臟疾病如RIF等疾病的進(jìn)展，故利用RIF動(dòng)物模型進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募靶枰?，分析各種不同模型建立方法的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)慕７椒ā?/p>