王歡

【摘 要】近年來，腸道病毒71引發(fā)的手足口病發(fā)病率在我國呈上升趨勢，嚴(yán)重危害兒童健康。本研究利用已有的重組原核表達(dá)載體pET32a-VP1，在大腸桿菌BL21內(nèi)誘導(dǎo)其表達(dá)VP1融合蛋白，使用鎳柱親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE結(jié)果表明重組蛋白表達(dá)且純化濃度較高，可用于今后的EV71抗原表位篩選與抗EV71病毒疫苗開發(fā)研究。

【關(guān)鍵詞】腸道病毒71；VP1；重組蛋白；純化

[Abstract] Recently， Hand-foot-mouth disease （HFMD） caused by Enterovirus 71 （EV 71） outbreak widely in China， which endanger childrens health. In this study， pET32a-VP1 was expressed in E.coli BL21 with the inducement of IPTG. The recombination protein was purified by Ni2+-NTA and indentified by SDS-PAGE， the result of which showed high purity of the recombination protein of VP1.It could provide the bases for research of EV71 epitope screening and new anti-EV71 vaccines.

[Key words] EV71； VP1； Recombination protein； Purification

柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）等腸道病毒是引起手足口?。℉and-foot-mouth Disease，HFMD）的主要病原體[1]，在我國，尤其以柯薩奇病毒A組16型（COX A16）與EV71最為常見。但感染除了引起HFMD外，EV71還能夠引起脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、無菌性腦膜炎、腦干腦炎和等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的癥狀[2]。自1969年首次被分離以來，EV71病毒已在美國、澳大利亞、歐洲和東南亞等地內(nèi)引起十多次暴發(fā)與流行[3-6]。我國自2008年3月以來，已在多個省份出現(xiàn)了HFMD的流行[7]，而且由于HFMD潛伏期長，癥狀不明顯，治療極易延誤，因此，開發(fā)相應(yīng)疫苗類與快速診斷試劑是防控HFMD的主要方法。EV71病毒顆粒由二十面體的球形蛋白外殼和其中包裹的單鏈正義RNA組成，其中外殼蛋白由VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成[8]。研究表明，VP1、VP2、VP3上含有EV71的主要抗原決定簇[9]。本研究利用已構(gòu)建完成的pET32a-VP1原核表達(dá)載體，進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白質(zhì)純化與鑒定，以期為今后腸道病毒EV71疫苗的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒pET32a-VP1與大腸桿菌BL21為本實驗室保藏，質(zhì)粒提取試劑盒與Ni2+-NTA柱料購自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

VP1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將pET32a-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（50mg/mL）的LB平板過夜培養(yǎng)，次日挑取陽性菌落并接種于 100 mL 含有卡那霉素（50mg/mL）LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。以1%的接種量接種到1 L含有卡那霉素（50mg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min 培養(yǎng)。以比濁法檢測600nm下OD值，當(dāng) OD值為0.6時，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（0.2 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，16℃，180 r/min培養(yǎng)過夜。次日4℃，5000 r/min下離心收集菌體細(xì)胞沉淀。使用20 mL結(jié)合緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L，咪唑pH7.4）重懸菌體細(xì)胞，并加入抑肽酶（100 mg/L）與亮抑酶肽（100 mg/L），抑制蛋白酶活性。

鎳柱親和層析在1200 bar壓力下超聲波破碎細(xì)胞，4℃，12000 r/min離心，取上清液過鎳柱兩次。用1mL結(jié)合緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25mmol/L 咪唑，pH7.4）洗滌柱子，重復(fù)兩次。用1mL洗脫緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.4）洗脫目的蛋白，重復(fù)3次，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

2 結(jié)果與分析

pET32a-VP1轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞破碎，離鎳柱親和層析純化與SDS-PAGE檢測，電泳結(jié)果表明在接近40kDMarker處有目的蛋白條帶（圖1），與預(yù)期產(chǎn)物大小（42kD）一致，表明本重組蛋白表達(dá)量較高、雜蛋白含量少。

本研究在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組pET32a-VP1蛋白，產(chǎn)物經(jīng)過細(xì)胞破碎，鎳柱親和層析純化與SDS-PAGE鑒定，表明本重組蛋白表達(dá)量較高，雜質(zhì)少，溶解性高。在本研究的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步進(jìn)行腸道病毒EV71抗血清制備及其免疫原性分析等研究，從而為HFMD新型疫苗的開發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2000：606-613.

[2] Chumakov M， Voroshilova M， Shindarov L， et al. Enterovirus 71 isolated from cases of epidemic poliomyelitis-like disease in bulgaria[J]. Arch Virol， 1979， 60（3/4）： 329-340.endprint

[3] Blomberg J， Lycke E， Ahlfors K， Johnsson T， Wolontis S， von Zeipel G.， Letter： New enterovirus type associated with epidemic of aseptic meningitis and-or hand， foot， and mouth disease[J]. Lancet， 1974，2， 112.

[4] Nagy， G.， Takatsy， S.， Kukan， E.， Mihaly， I.， Domok， I.， 1982. Virological diagnosis of enterovirus type 71 infections： experiences gained during an epidemic of acute CNS diseases in Hungary in 1978[J]. Arch. Virol. 71， 217-227.

[5] AbuBakar， S.， Chee， H.Y.， Al-Kobaisi， M.F.， Xiaoshan， J.， Chua， K.B.， Lam， S.K.， 1999. Identification of enterovirus 71 isolates from an outbreak of hand， foot and mouth disease （HFMD） with fatal cases of encephalomyelitis in Malaysia[J]. Virus Res. 61， 1-9.

[6] Lee， M.S.， Lin， T.Y.， Chiang， P.S.， Li， W.C.， Luo， S.T.， Tsao， K.C.， Liou， G.Y.， Huang， M.L.， Hsia， S.H.， Huang， Y.C.， Chang， S.C.， 2008. An investigation of epidemic enterovirus 71 infection in Taiwan， 2008： clinical， virologic， and serologic features. Pediatr[J]. Infect Dis J. 29， 1030-1034.

[7] Mao LX， Wu B， Bao WX， et al. Epidemiology of hand， foot， and mouth disease and genotype characterization of enterovirus 71 in Jiangsu， China[J]. J Clin Virol， 2010， 49（2）： 100-104.

[8] Podin Y， Gias EL， Ong F， et al. Sentinel surveillance for human enterovirus71 in sarawak， malaysia： lessons from the first 7 years[J]. BMC Public Health， 2006， 6： 180.

[9] Oberste MS， Maher K， Kilpatrick DR， et al. Molecular evolution of the human enteroviruses： correlation of serotype with VP1 sequence and application to Picornavirus classification[J].J Virol， 1999， 73（3）： 1941-1948.endprint