王文平 倪健 楊春靜 張欣 王慶玲 董曉旭 冷新 尹興斌 馮淬靈

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，前者習(xí)稱“毛橘紅”，后者習(xí)稱“光七爪”“光五爪”[1]，味辛、苦，性溫，歸肺、脾經(jīng)，其功能是理氣寬中、燥濕化痰。藥理研究表明[2]化橘紅揮發(fā)油有明顯的鎮(zhèn)咳、化痰作用。連翹為木犀科植物連翹Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果實，味苦，性微寒，具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱的作用。文獻研究表明[3]，連翹揮發(fā)油具有抗炎作用，抗炎機理與抑制炎癥介質(zhì)PGE2和組胺、五羥色胺的釋放有關(guān)。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥塊根，具有補血活血，補氣調(diào)經(jīng)等功效[4]。當(dāng)歸揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯具有較強的解痙平喘作用[5]，可松弛支氣管平滑肌，對抗組織胺、乙酰膽堿引起的支氣管哮喘。

慢阻肺(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)與肺部的異常炎癥有關(guān)[6-7]，主要癥狀為氣短、慢性咳嗽、咳痰、喘息和胸悶。芪蛭益肺顆粒是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院治療COPD的臨床經(jīng)驗方，方中化橘紅、當(dāng)歸、連翹三味藥的揮發(fā)油對COPD癥狀有明顯治療作用，故本實驗對以上三味藥采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，優(yōu)化揮發(fā)油的提取工藝；為減少揮發(fā)油成分在制劑生產(chǎn)及儲藏過程損失，同時為了更好地將揮發(fā)油成分與水提浸膏混合，本實驗對混合揮發(fā)油進行包合，并以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝[8]，并利用顯微成像分析和X射線衍射法對包合物進行表征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZNCL-S-10D多點智能磁力攪拌器(河南愛博特科技發(fā)展有限公司)，ZDHW型調(diào)溫電熱套(北京市中興偉業(yè)儀器有限公司，BT125D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DZ-28BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，XD-3X射線衍射儀(北京普析通用儀器有限公司)，Olympus顯微系統(tǒng)和DP71圖像采集系統(tǒng)。

1.2 試藥

藥材購自北京同仁堂(亳州)飲片公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定：化橘紅(生產(chǎn)批號：501002809)為蕓香科植物柚Citrusgrandis‘Tomentosa’的干燥外層果皮，連翹(生產(chǎn)批號：500003182)為木犀科植物連翹Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果實，當(dāng)歸(生產(chǎn)批號：501002827)為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥塊根。β-環(huán)糊精(分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20151030)，無水乙醇(北京化工廠，批號：20160606)實驗用水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合揮發(fā)油的提取

稱取化橘紅、連翹、當(dāng)歸飲片，按照2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)附錄2204揮發(fā)油測定法(甲法)提取，收集揮發(fā)油?；偌t、連翹、當(dāng)歸混合油為黃色透明液體，用封口膜密閉，置于4℃冷藏備用。

2.1.1 單因素考察 以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，采用單因素實驗考察浸泡與否、加水倍量、提取時間對化橘紅、當(dāng)歸、連翹混合揮發(fā)油得率的影響。將當(dāng)歸破碎成2 cm左右小塊，化橘紅、連翹不粉碎進行揮發(fā)油提取。放大藥量至三味藥各加200 g，共600 g，進行混合油最佳提取工藝的篩選。

2.1.2 浸泡與否的考察 稱取化橘紅、當(dāng)歸、連翹各200 g，共600 g，加入12倍量的水，分別浸泡0、2小時后提取。揮發(fā)油的提取量分別為2.88 mL、2.89 mL，由此得出結(jié)論：浸泡與否對于揮發(fā)油的得率沒有顯著影響，故選擇不浸泡提取揮發(fā)油，減少了工序，節(jié)省了時間和成本。

2.1.3 揮發(fā)油提取工藝的考察 稱取化橘紅、當(dāng)歸、連翹藥材各200 g，共600 g，分別加入10、12、14倍量的水，提取揮發(fā)油，記錄不同時間揮發(fā)油的提取量，為保持實驗結(jié)果的準確性，選擇同一電熱套、同一揮發(fā)油提取器，并且在提取過程中控制相同的溫度，本實驗控制加熱條件，即調(diào)至360 V至沸騰，之后降至250 V保持微沸。實驗結(jié)果如表1所示。實驗結(jié)果表明12倍量水提取所得揮發(fā)油量最大，揮發(fā)油得率為0.48%，并且提取10小時后揮發(fā)油提取量已達總量的90%，綜合中試加工時間限制及提取成本因素，選擇最佳提取工藝為12倍量水提取10小時。

2.1.4 驗證實驗 按照優(yōu)選出來的揮發(fā)油的提取工藝，即化橘紅、連翹、當(dāng)歸每味藥加入200 g，不浸泡，加入12倍量水，提取10小時，平行進行3次驗證實驗，實驗結(jié)果如表2所示。實驗結(jié)果表明該揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行。

表1 揮發(fā)油提取工藝結(jié)果

表2 揮發(fā)油提取驗證實驗

2.2 包合工藝的考察

2.2.1 空白回收率 實驗取1 mL揮發(fā)油于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，測得揮發(fā)油的空白回收率為80%。

2.2.2 正交實驗 設(shè)計通過查閱文獻[9-10]及綜合考慮揮發(fā)油包合物制備方法，選擇飽和水溶液法對揮發(fā)油進行包合。正交實驗采用L9(34)正交設(shè)計表，以揮發(fā)油的包合率為指標(biāo)，考察影響包合物生成的三因素包合溫度、包合時間、油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例對包合物生成的影響，每個因素下三個水平。因素水平見表3。

表3 包合工藝正交試驗因素水平表

2.2.3 包合物的制備 按照正交表4，稱取規(guī)定重量的β-CD于錐形瓶中，分別加入蒸餾水60 mL、80 mL、100 mL于設(shè)定好溫度的水浴鍋上加熱溶解，制成β-CD飽和溶液，置于磁力攪拌器上恒溫。揮發(fā)油1 mL加無水乙醇制成50%(v/v)的無水乙醇溶液，超聲使油與無水乙醇混合均勻，之后緩慢加入到環(huán)糊精溶液中，加塞，攪拌至規(guī)定時間，冷卻至室溫，放入冰箱，冷藏24小時，抽濾，包合物用適量的水洗滌，再用10 mL無水乙醇洗滌，濾層和濾紙一同取出，置于真空干燥箱中，40℃下干燥4小時，即得。

2.2.4 包合率的測定 分別取9組干燥好的包合物，置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，連接揮發(fā)油提取裝置，提取揮發(fā)油，保持微沸5小時，至油量不再增加，計算揮發(fā)油的包合率，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。結(jié)果分析：由方差分析結(jié)果顯示，A、B、C三因素的P值均小于0.05，說明A、B、C三因素均具有顯著性差異，通過k值比較，最終確定最佳提取工藝為A2B3C3，即40℃，油(mL)∶β-CD(g)∶比例為1∶10∶100，提取3小時。

表4 混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交實驗結(jié)果

表5 混合揮發(fā)油β-CD包合工藝的方差分析

2.2.5 三批驗證實驗 按照優(yōu)選的揮發(fā)油的最佳包合工藝，進行3批平行驗證實驗，結(jié)果見表6，三批驗證試驗平均包合率為95.83%，大于正交表中的最佳包合率93.75%，說明該包合工藝穩(wěn)定可行。

表6 揮發(fā)油包合驗證實驗

2.3 包合物表征

2.3.1 包合物的顯微成像 分別取適量β-CD、揮發(fā)油與β-CD物理混合物及包合物，過100目篩，分別放于3張載玻片上，以少量蒸餾水分散溶解，蓋上蓋玻片，于10×10倍顯微鏡下觀察。β-CD、揮發(fā)油與β-CD物理混合物、揮發(fā)油包合物顯微圖分別如圖1所示。β-CD在顯微鏡下呈不規(guī)則透明團塊，成像清晰；物理混合物類似于β-CD，且有大量細小油滴存在。包合物的顯微圖與以上二者具有明顯區(qū)別，包合物已經(jīng)形成且包合狀態(tài)良好。

注：A為β-CD；B為物理混合物；C為包合物

2.3.2 X射線衍射法 取空白β-CD、混合揮發(fā)油與β-CD的物理混合物、β-CD與混合油的包合物分別進行X射線衍射，以掃描角度為橫坐標(biāo)，衍射強度為縱坐標(biāo)，采用Origin軟件繪制X射線粉末衍射圖。結(jié)果如圖2所示。由圖所示，包合物的衍射峰在2θ=6～8°、 16～18°、 20°、 24°產(chǎn)生新的吸收峰，在2θ=10°、 26～27°、 32°、 35°的峰消失，說明混合油與β-CD形成了包合物。

注：A為β-CD；B為物理混合物；C為包合物

3 討論

本實驗利用現(xiàn)代包合技術(shù)，將揮發(fā)油包合在β-CD分子之中，獲得穩(wěn)定的包合物。本研究結(jié)果顯示，最佳提取工藝是不浸泡，加10倍量水，提12小時。最佳包合工藝為：油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例為1∶10∶100，包合溫度為40℃，包合時間為3小時。通過顯微鏡法、X射線衍射法對揮發(fā)油進行表征，結(jié)果顯示包合物形成且包合狀態(tài)良好。該工藝操作方便，實用性強，有利于生產(chǎn)。

化橘紅、當(dāng)歸、連翹的混合揮發(fā)油成分比較復(fù)雜，單憑揮發(fā)油的提取率和包合率來表示揮發(fā)油的提取會有一定的局限性。后期可以測定一下不同提取工藝和包合工藝中各成分含量差別進行完善。

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