劉曉強,丁 建

(常州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心,常州 213101)

甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate)化學名為6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸鹽,是Japan Tobacco公司研發(fā)的非肽類蛋白酶抑制劑[1],首次上市是在1986年的日本,主治臨床急性胰腺炎[2-3]。在甲磺酸萘莫司他的制備工藝中,由于所用原料、試劑等多種因素影響,在制得的甲磺酸萘莫司他原料藥中可能會有甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)等雜質生成[4-5]。而甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯等甲磺酸酯類化合物均具有較強的潛在性遺傳毒性雜質,嚴重威脅患者的健康,故需要對其含量進行控制[5]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GCMS-QP-2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；XS105DU電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 甲磺酸萘莫司他(江蘇杜瑞制藥有限公司,批號840901)；甲磺酸甲酯對照品(百靈威科技有限公司,批號LSB0N36,質量分數99%)；甲磺酸乙酯對照品(阿法埃莎化學有限公司,批號10169291,質量分數99%)；乙腈為色譜純(德國默克公司)；實驗用水為純凈水；碘化鈉和無水硫代硫酸鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX(安捷倫科技有限公司,30 m×0.250 mm,0.50 μm)；進樣口溫度：200 ℃；柱溫：采用程序升溫法,起始溫度設為35 ℃,維持3 min,再以30 ℃·min-1的速率升溫至180 ℃,維持2 min；載氣類型：氦氣；載氣流速：恒壓模式(100 kPa)；進樣量：1.0 mL；分流比：1∶12；平衡時間：30 min；進樣方式：頂空進樣；平衡溫度：60 ℃。

質譜：離子源溫度：250 ℃；接口溫度：150 ℃；電離源：電子轟擊離子化(EI)；分析器：四級桿質量分析器；離子源溫度：250 ℃。選擇性離子模式(SIM)檢測,碘代丁烷(BuI)定量離子m/z為184,碘代甲烷(MeI)為142,碘代乙烷(EtI)為156,BuI、MeI和EtI依次由甲磺酸丁酯(BMS)、甲磺酸甲酯(MMS)及甲磺酸乙酯(EMS)經衍生化反應形成。

2.2溶液的制備

2.2.1衍生化溶液 稱取碘化鈉60.0 g和無水硫代硫酸鈉30 mg,置于同一50 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(避光保存)。

2.2.2內標溶液 精密量取甲磺酸丁酯50 μL,置于50 mL量瓶中,用乙腈-水(8∶2)稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述溶液500 μL,置于250 mL量瓶中,用乙腈-水(2∶8)稀釋至刻度,搖勻；再精密量取上述溶液100 mL,置于1 000 mL量瓶中,同樣用乙腈-水(2∶8)稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.3對照品儲備液 精密稱取甲磺酸甲酯及甲磺酸乙酯各25 mg,共同置于5 mL量瓶中,用甲苯溶解并稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述溶液50 μL,移至25 mL量瓶中,加乙腈2 mL,用內標溶液稀釋至刻度,制成每1 mL中含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯各10 μg 的溶液,即得。

2.2.4對照品溶液(1) 精密量取2.2.3項下制備的對照品儲備液50 μL,置于50 mL量瓶中,用內標溶液稀釋至刻度；依次精密量取2.2.1項下制備的衍生化溶液與上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.2.5對照品溶液(2) 精密量取2.2.3項下制備的對照品儲備液150 μL,置于20 mL量瓶中,用內標溶液稀釋至刻度；依次精密量取2.2.1項下制備的衍生化溶液與上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.2.6供試品溶液 精密稱取本品25 mg,置于20 mL頂空瓶中,依次精密加入2.2.1項下制備的衍生化溶液與2.2.2項下制備的內標溶液各0.5 mL,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.3方法學驗證

2.3.1標準曲線 分別取2.2.3項下制備的對照品儲備液30,50,50,150和1 000 μL,分別置于100,50,20,20和50 mL量瓶中,用內標溶液稀釋至刻度,使其質量濃度分別為3,10,25,75 和200 ng·mL-1。再依次量取上述各溶液0.5 mL,與2.2.1項下制備的衍生化溶液0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封。

結果表明,甲磺酸甲酯擬合曲線為y=0.015 5x+0.152 1,r=0.997 5；甲磺酸乙酯擬合曲線為y=0.016x+0.007 1,r=0.999 9。甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯質量濃度在3.0～200.0 ng·mL-1的范圍內線性關系良好。

2.3.2檢出限和定量限 甲磺酸甲酯的定量限為2.892 8 ng·mL-1,信噪比為19.5∶1,檢測限為0.964 3 ng·mL-1,信噪比為16.5∶1；甲磺酸乙酯的定量限為3.022 3 ng·mL-1,信噪比為13.8∶1,檢測限為1.007 8 ng·mL-1,信噪比為9.7∶1。

2.3.3精密度 取2.2.3項下制備的對照品儲備液150 μL,置于20 mL量瓶中,用內標溶液稀釋至刻度,搖勻；依次取上述溶液及2.2.1項下制備的衍生化溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,立即密封。

甲磺酸甲酯的峰面積之比的RSD值為0.9%,甲磺酸乙酯的峰面積之比的RSD值為1.3%。

2.3.4加樣回收率 分別取2.2.3項下制備的對照品儲備液120,150和180 μL,分別置于20,20和20 mL量瓶中,用內標溶液稀釋至刻度,搖勻；依次取上述各溶液0.5 mL、2.2.1項下制備的衍生化溶液0.5 mL及樣品25 mg,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,制成含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯分別為低、中、高質量濃度的溶液各3份。

甲磺酸甲酯的平均回收率為102%,RSD值為2.9%；甲磺酸乙酯的平均回收率為106%,RSD值為1.2%,見表1～2。

表1甲磺酸甲酯加樣回收率實驗結果

Tab.1 The results of recovery tests of mthylmesylate (n=9)

表2甲磺酸乙酯加樣回收率實驗結果

Tab.2 The results of recovery tests of ethylmesylate (n=9)

2.4樣品測定 樣品中甲磺酸甲酯的含量為0.000 01%,甲磺酸乙酯的含量為0,甲磺酸酯的總含量為0.000 01%,見圖1。結果表明,甲磺酸酯的總含量符合規(guī)定(標準規(guī)定：甲磺酸酯總含量不得超過0.000 5%)。

圖1GC-MS圖

A.對照品；B.樣品；1.碘化甲烷；2.碘化乙烷3.碘化丁烷。

Fig.1 GC-MS chromatograms

A.reference substance；B.sample；1.methyl iodide；2.ethyl iodide；3.butane iodide.

3 小結

近年來,對各種原料藥中甲磺酸酯類雜質檢測研究的較多,常用的方法包括氣相色譜法(GC-FID、GC-ECD)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)以及離子色譜等[6-12],筆者參考《歐洲藥典》(EP)8.0版附錄提出使用衍生化頂空GC-MS法測定甲磺酸酯類雜質含量的方法,本實驗采用衍生化頂空GC-MS法,同時為了減少進樣誤差等因素對檢測結果的影響,采用內標法進行樣品的測定,選擇待測物同系物甲磺酸丁酯為內標。

甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸丁酯沸點較高,均大于200 ℃[13],無法對其進行氣化測定,因此實驗采用柱前衍生化法,使甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丁酯與碘離子作用分別轉化為碘代甲烷、碘代乙烷和碘代丁烷,沸點明顯降低,適用于氣相色譜法進行測定。同時,通過柱前衍生化法將原先的鹽轉化為中性物質,增強其在色譜柱上的保留行為,改善峰形,提高了柱效和檢測靈敏度[14-17],有益于更好地控制甲磺酸萘莫司他中上述2種成分的含量。

直接進樣法或頂空進樣法均可測定甲磺酸酯類化合物的含量,但由于直接進樣法操作簡便,會將大量其余物質帶入系統(tǒng),增加系統(tǒng)污染風險,而頂空進樣法可有效控制污染,通過柱前衍生化法,將待測物及內標物質轉化為沸點降低的小分子物質,便于頂空進樣的實施。

本次實驗通過上述方法測定,得到甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的線性范圍分別為3.0～200.0(r=0.997 5)和3.0～200.0 ng·mL-1(r=0.999 9)；檢測限分別為0.964 3 和1.007 8 ng·mL-1；定量限分別為2.892 8和3.022 3 ng·mL-1；進樣精密度的RSD值分別為0.9%和1.3%；平均加樣回收率分別為102%(RSD=2.9%)和106%(RSD=1.2%)。

綜上所述,本實驗建立了柱前衍生化和GC-MS聯(lián)用的方法測定甲磺酸萘莫司他中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量,該方法簡單、靈敏度高、重復性好,可用于甲磺酸萘莫司他中甲磺酸酯類化合物的含量測定。

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