王元琮， 何 冰

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇南京 210014)

利用微藻生產(chǎn)生物能源越來越受到人們的重視。微藻是一種可以高效利用光能和二氧化碳合成油脂的單細(xì)胞或簡(jiǎn)單多細(xì)胞微生物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快速、產(chǎn)油量高等特點(diǎn)。與植物類似，微藻可以通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能并以糖、蛋白和油脂的形式存儲(chǔ)起來[1]。一般認(rèn)為，當(dāng)微藻處于逆境脅迫條件下，會(huì)限制自身的生長(zhǎng)，同時(shí)提高自身的油含量，以更好地幫助自己適應(yīng)環(huán)境[2]。

當(dāng)植物處于逆境中時(shí)，體內(nèi)會(huì)積累活性氧。微量的活性氧具有信號(hào)分子的作用，可以調(diào)節(jié)植物產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，應(yīng)對(duì)環(huán)境中的脅迫。但是當(dāng)活性氧的積累量過多時(shí)，就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生傷害。過氧化氫(H2O2)是活性氧的一種，一般情況下在細(xì)胞中通過光呼吸形成。過氧化氫的過多積累會(huì)導(dǎo)致氧化性損傷，進(jìn)而破壞細(xì)胞的新陳代謝和完整性，最終造成細(xì)胞死亡[3-4]。最近有研究表明，用微量H2O2處理海藻會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，高濃度的H2O2則會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)[5-6]。也有研究認(rèn)為，H2O2處理小球藻(Chlorellavulgaris)雖然可以顯著抑制其生長(zhǎng)，但同時(shí)也能夠顯著提高其油含量，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到 4 mmol/L 時(shí)，總油脂產(chǎn)量會(huì)有顯著提高，更高濃度的H2O2則會(huì)完全殺死藻細(xì)胞[7-9]。一般認(rèn)為，H2O2對(duì)微藻的毒性主要是因?yàn)镠2O2在微藻細(xì)胞內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為活性極高的羥基自由基(·OH)，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)以及DNA[10-11]，在高濃度H2O2脅迫下，微藻會(huì)主動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成，降低生長(zhǎng)速率，轉(zhuǎn)而把更多的能量以油脂的形式存儲(chǔ)起來[12-13]。盡管關(guān)于活性氧對(duì)于微藻的生長(zhǎng)、油脂積累的影響已經(jīng)有不少研究，但是關(guān)于外源H2O2處理對(duì)微藻基因表達(dá)的影響至今仍然缺乏相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步分析活性氧對(duì)微藻干質(zhì)量和油脂積累影響的分子機(jī)制，筆者以前一段時(shí)間報(bào)道的小球藻藻種ChlorellasorokinianaLS-2(以下簡(jiǎn)稱LS-2)作為研究材料[14]，用不同濃度H2O2進(jìn)行處理，并檢測(cè)LS-2的生長(zhǎng)量、產(chǎn)油量以及相關(guān)基因的表達(dá)變化，以期為解析小球藻響應(yīng)外源H2O2的分子機(jī)制提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種與試劑

本試驗(yàn)所用藻種為筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選出來的小球藻(Chlorellasorokiniana)LS-2[14]，已提交至中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC 8710。過氧化氫(H2O2，30%，分析純)購自西隴化工股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法和條件

培養(yǎng)方法和條件參考已有的報(bào)道[15]，將藻種保存于液體Tris-Acetate-Phosphate(TAP)培養(yǎng)基內(nèi)，接種時(shí)選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞，接入150 mL TAP培養(yǎng)基，保證接入后D680 nm=0.042。培養(yǎng)溫度為26 ℃，每天光—暗周期為12 h—12 h，光照度為4 800 lx。

培養(yǎng)基接入對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞后，隨即加入適量H2O2至所需工作濃度。

1.3 藻細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)定

取20 mL達(dá)到所需生長(zhǎng)時(shí)間的藻細(xì)胞，放入50 mL離心管中離心收集藻細(xì)胞(5 000 r/min，5 min)。將收集下來的藻細(xì)胞放入烘箱，95 ℃烘20 min，然后調(diào)至75 ℃烘至恒質(zhì)量，用分析天平稱量藻細(xì)胞的質(zhì)量，計(jì)算得出干質(zhì)量。

1.4 油脂提取

將生長(zhǎng)9 d的藻液倒入50 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min后收集藻細(xì)胞。往離心管中加入5 mL濃鹽酸(HCl，38%)，置于75 ℃水浴20 min。取出離心管后加入5 mL無水乙醇，靜置冷卻至室溫。加入10 mL無水乙醚，渦旋振蕩 1 min，放入離心機(jī)內(nèi)，于4 000 r/min離心1 min，分層后萃取上層并加入圓底燒瓶。重復(fù)3次直至萃取干凈。將圓底燒瓶放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，讓有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈后稱質(zhì)量，計(jì)算總脂含量，相關(guān)公式如下：

總脂產(chǎn)量(mg/L)=提取油脂質(zhì)量(mg)/提取樣品體積(L)；

油脂含量(mg/g)=提取油脂質(zhì)量(mg)/提取樣品干質(zhì)量(g)。

1.5 RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同處理的藻細(xì)胞，收集后用液氮研磨，加入TRIzol(Invitrogen)，按照說明書提取。提取的RNA用RNAase-free DNAase I(TaKaRa)于37 ℃處理 20 min，消化剩余的DNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明將產(chǎn)物總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0。多重比較采用的是最小顯著差數(shù)法(least significant difference，簡(jiǎn)稱LSD)。P<0.05被視為差異顯著。2組樣本比較采用t檢驗(yàn)方法(Student’st-test)，P<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫濃度對(duì)小球藻(LS-2)干質(zhì)量積累的影響

在TAP培養(yǎng)基中接入等量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LS-2，并加入不同濃度的過氧化氫(0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)，分別在3、6、9 d測(cè)定其干質(zhì)量。圖1結(jié)果表明，隨著處理濃度的升高，微藻的生長(zhǎng)速率受到抑制的程度越大，不同濃度過氧化氫對(duì)于干質(zhì)量積累的抑制在處理3 d和處理6 d時(shí)較為明顯。接種LS-2后3 d，0.5 mmol/L H2O2處理的干質(zhì)量為(0.385±0.025)g/L，比對(duì)照的(0.580±0.020)g/L下降了約33.6%。而用2.0 mmol/L H2O2處理的培養(yǎng)基中，LS-2幾乎無法檢測(cè)到生長(zhǎng)。接種后6 d，對(duì)照干質(zhì)量達(dá)到(2.028±0.376)g/L，不同濃度H2O2處理的干質(zhì)量分別比對(duì)照下降了35.7%[0.5 mmol/L H2O2處理，(1.305±0.657)g/L]、66.2%[2.0 mmol/L H2O2處理，(0.686±0.103)g/L]。接種后9 d，對(duì)照干質(zhì)量為(2.365±0.513)g/L，0.5、1.0 mmol/L H2O2處理在干質(zhì)量上與對(duì)照均無顯著差異，分別為(2.258±0.187)、(2.258±0.065)g/L。當(dāng)用1.5 mmol/L H2O2處理時(shí)，干質(zhì)量下降約9.6%，為(2.137±0.019)g/L；H2O2濃度增至 2.0 mmol/L 時(shí)，干質(zhì)量下降約17.3%，為 (1.955±0.033)g/L。以上結(jié)果表明，外源H2O2處理小球藻會(huì)抑制其生長(zhǎng)速率，當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mmol/L時(shí)，會(huì)明顯降低LS-2的最大干質(zhì)量。

2.2 過氧化氫處理對(duì)LS-2油脂積累的影響

為了探討H2O2對(duì)LS-2油脂積累的影響，筆者在接種 9 d 后分別提取了不同處理的LS-2的總油脂并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，H2O2處理對(duì)LS-2油脂總產(chǎn)量的影響不顯著(圖2-A)，但是2 mmol/L H2O2處理與對(duì)照處理相比，顯著增加了LS-2的油脂含量，提升了28.6%(圖2-B)。這與之前報(bào)道的H2O2在小球藻(Chlorellavulgaris)中產(chǎn)生的效果一致。

2.3 H2O2處理對(duì)LS-2碳固定相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究H2O2處理對(duì)LS-2生長(zhǎng)影響的機(jī)制，筆者分別提取了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照和2 mmol/L H2O2處理微藻細(xì)胞的RNA，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果見圖3。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用不可或缺的關(guān)鍵酶。其功能是催化第1個(gè)主要的碳固定反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，2.0 mmol/L H2O2處理的LS-2中，其轉(zhuǎn)錄水平有了顯著提高，是對(duì)照轉(zhuǎn)錄水平的9倍(圖3-A)。磷酸甘油酸變位酶a(phosphoglycerate mutase a，簡(jiǎn)稱PGKa)和醛縮酶(fructose-1，6-bisphosphate aldolase，簡(jiǎn)稱ALDO)在LS-2卡爾文循環(huán)中位于Rubisco的下游，編碼它們的基因在2.0 mmol/L H2O2處理下轉(zhuǎn)錄水平僅為對(duì)照水平的1/2(圖3-B、圖3-C)。由此可見，在2.0 mmol/L H2O2處理下，雖然Rubisco轉(zhuǎn)錄有了提高，但卡爾文循環(huán)仍然受到了一定的抑制，這很可能是 2.0 mmol/L H2O2處理下微藻生長(zhǎng)受到抑制的主要原因之一。

2.4 H2O2處理對(duì)LS-2油脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步解釋H2O2處理增加LS-2油脂含量的機(jī)制，筆者檢測(cè)了油脂合成途徑前2步的關(guān)鍵基因，即編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)及其下游的編碼酰基載體蛋白(ACPa、ACPb)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示， 2.0 mmol/L H2O2處理LS-2藻細(xì)胞ACCase的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照處理相比變化不大，略有下降(圖4-A)。但是下游的ACPa、ACPb的轉(zhuǎn)錄水平都提升了1倍以上(圖4-B、圖4-C)。這有助于將ACCase催化的產(chǎn)物盡可能地轉(zhuǎn)化為丙二酰-ACP，并進(jìn)入隨后的脂肪酸合成途徑，為盡可能多地合成脂肪酸提供了條件。

2.5 H2O2處理對(duì)LS-2糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響

糖酵解途徑的中間產(chǎn)物可以作為油脂合成的底物。筆者進(jìn)一步驗(yàn)證了H2O2處理對(duì)LS-2中編碼糖酵解途徑最后2步的關(guān)鍵酶，即烯醇化酶(enolase，簡(jiǎn)稱ENL)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，簡(jiǎn)稱PK)的基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，H2O2處理的藻細(xì)胞ENL的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照上調(diào)了7倍(圖5-A)，但是其下游編碼關(guān)鍵酶的PKa、PKb轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照變化不大，其中PKa略有下調(diào)，PKb略有上調(diào)(圖5-B、圖5-C)，暗示這2種丙酮酸激酶可能受脅迫的影響略有不同。以上結(jié)果表明，LS-2藻細(xì)胞的糖酵解途徑并沒有受到外源H2O2的抑制。

3 討論與結(jié)論

植物在受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)積累包括過氧化氫在內(nèi)的多種活性氧。之前有報(bào)道表明，高濃度的H2O2會(huì)導(dǎo)致Rubisco折疊錯(cuò)誤，并且更容易失去活性[16]。此外，活性氧也可以作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)的基因表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理小球藻會(huì)使編碼Rubisco蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。筆者推測(cè)，這種轉(zhuǎn)錄水平的提高很可能是微藻為了應(yīng)對(duì)這種狀況而產(chǎn)生的補(bǔ)償效應(yīng)，因此盡管Rubisco的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其下游的卡爾文循環(huán)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平仍然受到了抑制。

之前有研究表明，微量的活性氧可以促進(jìn)海洋微藻的生長(zhǎng)，高濃度的活性氧則會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[5-6]。這種低濃度活性氧促進(jìn)生長(zhǎng)的效應(yīng)在作物中也有發(fā)現(xiàn)[17]。本研究對(duì)小球藻LS-2和之前對(duì)小球藻(Chlorellavulgris)的研究都表明，H2O2處理會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)造成抑制，低濃度的H2O2僅在前期對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速率有一定抑制， 對(duì)最終的生物量和油含量影響不大。本研究發(fā)現(xiàn)，外施H2O2能夠顯著提高小球藻LS-2的Rubisco轉(zhuǎn)錄水平。因此，筆者推測(cè)之前報(bào)道的中低濃度活性氧之所以具備促進(jìn)微藻生長(zhǎng)的能力可能部分是由于其一方面提升了Rubisco的轉(zhuǎn)錄，另一方面由于濃度過低沒有達(dá)到對(duì)Rubisco蛋白產(chǎn)生毒害的程度，這樣使得Rubisco總量增加，從而增加了碳固定所造成的。

之前有研究推測(cè)，微藻在脅迫條件下油脂含量增加是可能是由于其碳固定途徑受抑制的同時(shí)，糖酵解途徑受到的影響不大，相應(yīng)的糖酵解相對(duì)中間產(chǎn)物增多，這些產(chǎn)物為油脂合成提供了充足的底物[18-19]。本研究也表明，高濃度H2O2雖然能夠抑制卡爾文循環(huán)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，但提高了油脂合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)對(duì)于糖酵解途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄影響不大，這些基因表達(dá)的數(shù)據(jù)支持該推測(cè)，證明了小球藻在高濃度H2O2的脅迫下，能夠抑制自身碳固定途徑，加強(qiáng)油脂合成途徑，從而更好地在外部逆境下生存。

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