劉加愛，陳 蕾，林元山，張小鵑，鄒洪彬，張學(xué)文

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶或γ-淀粉酶，學(xué)名為α-1，4-葡萄糖水解酶(α-1，4-Glucanglucohydrolase)，是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一[1]。糖化酶是水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖的主要酶類，作為一種外切型糖苷酶，從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4-糖苷鍵連接的非還原端，水解成葡萄糖單元。因此，糖化酶被廣泛地應(yīng)用于食品、制酒、醫(yī)藥、有機酸、抗生素、氨基酸等發(fā)酵工業(yè)，是我國用量最大的酶制劑產(chǎn)品。

許多學(xué)者利用基因工程和分子生物學(xué)的手段對糖化酶基因進行了克隆、轉(zhuǎn)化及表達的研究[2-6]。通過基因工程改造該基因、改良工程菌株等，以提高酶的發(fā)酵生產(chǎn)效率或改善酶的適用性[7-10]。但未見黑曲霉糖化酶分泌性表達相關(guān)的報道。本研究利用RT-PCR從黑曲霉中克隆了其glaA基因cDNA，經(jīng)過改造除去了其信號肽區(qū)的編碼序列后將其克隆到酵母pVT102U/α表達載體上乙醇脫氫酶(ADH1)強啟動子下游[11]，并與α因子信號肽αMFL融合，以實現(xiàn)糖化酶的高效分泌表達。α胞外信號肽能有效將蛋白質(zhì)分泌到細胞外，可以更有效保證酶的向外分泌，使表達蛋白更易分離制備。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 黑曲霉(Aspergillusniger)、受體菌大腸桿菌DH5α、釀酒酵母S78和質(zhì)粒酵母表達載體pVT102U/α由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗中心保存。pMD18載體和基因操作相關(guān)的酶均購自TaKaRa公司。總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒、基因操作相關(guān)的試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL；酵母完全培養(yǎng)基YPD：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖；YSD培養(yǎng)基：以 YNB為基礎(chǔ)補加2%葡萄糖，再按質(zhì)粒的基因標記補加營養(yǎng)缺陷所需的亮氨酸、腺嘌呤、肌醇、2% 瓊脂；YPS篩選培養(yǎng)基：2%可溶性淀粉，1%酵母粉，2%蛋白胨，2%瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 cDNA文庫的構(gòu)建與篩選鑒定 TRIzol法提取黑曲霉總RNA，根據(jù)GenBank中已登錄的糖化酶基因序列設(shè)計并合成引物，軟件預(yù)測氨基酸序列(圖1)。通過RT-PCR技術(shù)得到糖化酶基因cDNA，試劑盒純化回收后與pMD18克隆載體16 ℃過夜連接，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。獲得重組質(zhì)粒并測序。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建 由于表達載體自身帶有胞外信號肽α因子[12]，根據(jù)軟件預(yù)測的糖化酶基因信號肽位點和選用載體的酶切位點XbaⅠ、HindⅢ設(shè)計引物，從pMD18-glaA上擴增glaA除去信號肽后的編碼序列，用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切g(shù)laA和pVT102U/α，膠回收目的片段，16 ℃過夜連接后，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切后電泳檢測并測序。質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖2。

1.2.3 重組表達載體LiAc法轉(zhuǎn)入釀酒酵母S78 挑取3～4 mm S78單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，250 r/min過夜培養(yǎng)。以1∶100接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，250 r/min，培養(yǎng)至OD值0.4～0.6。5 000 r/min，室溫離心5 min，將收集的菌體用1×TE洗滌。離心，將細胞重懸于2 mL LiAc/TE緩沖液中，室溫放置30 min。在EP管中混合新制備的酵母感受態(tài)細胞100 μL，10 μL carrier DNA和0.1～1.0 g pVT102U/α-glaA，700 μL 40% PEG4000，于 42 ℃熱激 7 min，轉(zhuǎn)化后的酵母懸浮液離心并重新懸于200 μL 1×TE緩沖液中，取50 μL涂布于YSD平板上[13]。30 ℃，培養(yǎng)3～4 d。

加粗字體為信號肽序列；普通字體為其編碼的氨基酸序列。The bold font is a signal peptide sequence；The ordinary font is encoded by the amino acid sequence.

圖2 重組酵母表達糖化酶質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.2 The flow chart of yeast expression recombinant vector construction

1.2.4 S78轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定與活性篩選 挑取YSD平板上的菌落溶于20 μL去離子水中，取10 μL用反復(fù)凍融法對酵母細胞進行破壁處理后，進行PCR擴增。擴增反應(yīng)體系為25 μL，包括上下游引物各1 μL，12.5 μL Mix，3.5 μL菌液，其余用水補足，以未轉(zhuǎn)化的S78鑒定作對照。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；然后以94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后，取20 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

用接種環(huán)挑取菌P結(jié)果正確的S78轉(zhuǎn)化子點種于2%可溶性淀粉平板上，30 ℃，培養(yǎng)2～3 d。用碘液染色后，篩選出有透明水解圈的轉(zhuǎn)化子。通過計算水解圈與菌落直徑的比值挑選出比值最大的重組轉(zhuǎn)化子用于后期酶活的研究。

1.2.5 重組釀酒酵母S78的表達與SDS-PAGE電泳 重組釀酒酵母S78在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，離心后收集上清液。取20 μL樣品與5 μL 5×上樣緩沖液混合，沸水浴5 min后，離心取上清全部點樣。蛋白膠用考馬斯亮藍G250染色30 min，再脫色30 min[14]。

1.2.6 重組糖化酶酶活檢測 以2%可溶性淀粉為底物，采用DNS法[15]測定糖化酶的活性。取0.2 mL待測酶液，加入0.8 mL 2%可溶性淀粉溶液作為反應(yīng)底物(用 pH值5.6，0.1 mol/L乙酸緩沖液配制)，70 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)5 min。用0.5 mol/L NaOH溶液滅酶活。加入DNS試劑2 mL，沸水反應(yīng)5 min后冷卻定容至20 mL，測定波長540 nm處光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉糖化酶基因的克隆及檢測

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中糖化酶基因的序列分析，glaA的長度為1 923 bp。提取黑曲霉總RNA后，通過RT-PCR技術(shù)，用高保真PfuDNA聚合酶擴增得到黑曲霉中糖化酶的cDNA序列約1.9 kb(圖3)，與理論相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化回收后，與克隆載體pMD18相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞，提取陽性克隆后，送至武漢生工公司測序。測序結(jié)果表明，與數(shù)據(jù)庫發(fā)表的glaA序列相似性為100%，證明已克隆得到黑曲霉糖化酶基因。

2.2 酵母重組表達載體pVT102U/α-glaA的構(gòu)建與鑒定

glaA與 pVT102U/α連接轉(zhuǎn)化后，在LB/Amp抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切，得到約1.9 kb的產(chǎn)物(圖4)。證明酵母重組表達載體pVT102U/α-glaA構(gòu)建成功。

M.5.0 kb分子量標準；1.pVT102U/α-glaA雙酶切；2.未酶切pVT102U/α-glaA；3.pVT102U/α空質(zhì)粒。M.5.0 kb DNA Marker；1.pVT102U/α-glaA digested with Xba Ⅰand Hind Ⅲ；2 .pVT102U/α-glaA without digestion；3.pVT102U/α plasmid.

2.3 陽性克隆PCR與篩選結(jié)果

pVT102U/α-glaA通過熱激法轉(zhuǎn)入釀酒酵母S78菌株，YSD營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選。從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子利用反復(fù)凍融法破壁后，進行Conoly PCR鑒定(圖5)。同時，將轉(zhuǎn)化子點種于YPS平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后，碘液染色觀察(圖6)。轉(zhuǎn)化子菌落附近出現(xiàn)了大小不一的透明水解圈，證實基因成功轉(zhuǎn)入釀酒酵母S78，并能分泌有生物學(xué)活性的酶。

2.4 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及電泳分析

SDS-PAGE分析可見，糖化酶分子質(zhì)量大約為80 kDa。由于載體帶有胞外信號肽α因子(圖7)，不需要進行細胞破碎，可直接取發(fā)酵液離心后的上清液進行試驗。避免了破壁過程中蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，保證了外源蛋白的完整性。

M.5.0 kb分子量標準；1.菌落PCR產(chǎn)物。M.5.0 kb DNA Marker；1.Yeast colony PCR product.

A.酵母S78；B.轉(zhuǎn)入pVT102U/α-glaA的酵母S78。A.Yeast S78；B.Transformed yeast S78.

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1～3.發(fā)酵24，48，72 h的粗酶液；4.空白對照。M.Protein molecular Marker ；1-3.Fermented 24，48，72 h of the crude enzyme solution respectively；4.CK.

2.5 重組酵母糖化酶活的測定

經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每24 h取樣測定糖化酶酶活大小。如圖8所示重組釀酒酵母發(fā)酵72 h，酶活達到最大值28.86 IU/mL(圖8)。由圖9可知，重組糖化酶在pH值6條件下，酶活力最大；由圖10可知，重組糖化酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，隨著溫度的升高，酶活力有所下降。

3 結(jié)論與討論

目前，糖化酶的工業(yè)化生產(chǎn)仍然受到很大的制約，其最主要的原因就是雖然黑曲霉是優(yōu)良的生產(chǎn)糖化酶的菌株，但野生黑曲霉菌株產(chǎn)酶水平較低，體現(xiàn)在淀粉水解時間比較長，發(fā)酵周期也受到其制約。楊麗娟等[16]采用基因改造的方法，將改造后的菌株與出發(fā)菌株生產(chǎn)糖化酶的產(chǎn)量及活性進行測定，發(fā)現(xiàn)酶活有所提高。本研究選用的pVT102U/α載體是優(yōu)良的酵母分泌型表達載體，最大的一個特點就是其具有乙醇脫氫酶(ADH1)啟動子，是在酵母中表達的強啟動子，活性受乙醇抑制，有利于利用酵母輕發(fā)酵高效表達糖化酶基因。在本試驗中，發(fā)酵時間以72 h為最佳，延長搖瓶發(fā)酵時間明顯降低酶的活性，可能就是由于72 h后乙醇的產(chǎn)生對啟動子活力的抑制引起的。這也說明在利用ADH1啟動子表達蛋白時，控制發(fā)酵時間很重要。王海燕等[17]構(gòu)建了ADH1啟動子和終止子引導(dǎo)表達的載體，使α-淀粉酶基因和糖化酶基因高效共表達，與酵母表達常用的甲醇誘導(dǎo)啟動子相比，發(fā)酵過程不需要甲醇誘導(dǎo)表達[18]，解決了產(chǎn)物商業(yè)化的問題，在食品醫(yī)藥方面將有很好的應(yīng)用。克隆除去糖化酶基因自身信號肽，并與載體上的胞外信號肽α-MFL融合，將蛋白質(zhì)分泌到細胞外，可以提高目標蛋白的分泌活性，使表達蛋白更易分離制備，避免了細胞破碎分離純化酶過程造成破壞。

圖8 不同發(fā)酵時間的糖化酶酶活Fig.8 Glucoamylase activity in fermentation liquid in different fermentation time

圖9 不同pH值條件下的糖化酶酶活力Fig.9 Glycosylase activity in fermentation liquid at different pH

圖10 不同溫度條件下的糖化酶酶活力Fig.10 Glycosylase activity in fermentation liquid at different temperature

重組釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵72 h，一般發(fā)酵酶活為28.86 IU/mL。在高溫(60 ℃)和最適pH值6條件下，產(chǎn)生的糖化酶酶活最高為39.98 IU/mL，比同類研究的酶活高出較多[19-20]。本試驗采用普通搖瓶發(fā)酵，存在著通氣不佳，影響了菌體的高密度生長及表達。因此，如果采用發(fā)酵罐發(fā)酵，通過調(diào)整通氣量、溫度、培養(yǎng)時間等，對重組酵母菌株的發(fā)酵條件進行進一步優(yōu)化，可能進一步提高酶活和表達效率。

[1] 黎衛(wèi)強.糖化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進展[J].沿海企業(yè)與科技，2010，20(4)：65-66，64.

[2] Acourene S，Ammouche A.Optimization of ethanol，citric acid，and alpha-amylase production from date wastes by strains ofSaccharomycescerevisiae，Aspergillusniger，andCandidaguilliermondii[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2012，39(5)：759-766.

[3] 郭彥言，王紅蕾，左小明，等.糖化酵母糖化酶基因在釀酒酵母中的克隆與表達[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，38(22)：8-10.

[4] Favaro L，Jooste T，Basaglia M，et al.Codon-optimized glucoamylases GAI ofAspergillusawamoriimproves starch utilization in an industrial yeast[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，95(4)：957-968.

[5] 徐榮燕，張亞波，謝 晨，等.疏綿狀嗜熱絲孢菌糖化酶基因(gla)的克隆及在畢赤酵母中的表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18(2)：362-367.

[6] 姚婷婷，王衍敏，顧建龍，等.攜多拷貝glaA的重組黑曲霉過量合成糖化酶的研究[J].生物工程學(xué)報，2006，22(4)：9.

[7] 曹慕琛，徐健勇，羅立超，等.黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在畢赤酵母X33中的表達[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(14)：8226-8230.

[8] 王 強，徐義兵，郭春和，等.黑曲霉糖化酶基因在畢赤酵母X33中的高效表達[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(4)：21-24.

[9] Sidra，Pervez，Nadir，et al.Phenotypic and molecular characterization ofAspergillusspecies for the production of starch-saccharifying amyloglucosidase[J].Annals of Microbiology，2015，65(4)：2287-2291.

[10] 張水龍，陳 東，曹樹威，等.黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在釀酒酵母中的表達[J].廣西科學(xué)，2013，20(2)：148-151.

[11] 林志楷，葉冰瑩，潘海芳，等.pVT102U/α-bgln重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定[J].福建師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，23(2)：17.

[12] 杜濟良，趙洪亮，薛 沖，等.不同信號肽對胞外β-(1，3)-葡聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中表達的影響[J].生物技術(shù)通訊，2010，21(6)：12.

[13] 崔鐵忠，盧康榮，李銀霞，等.釀酒酵母遺傳缺陷型菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化方法研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2016，16(8)：1420-1423.

[14] 張賀迎，武金霞.耐熱糖化酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(9)：10.

[15] 林 艷，馬瑩瑩，張宿義，等.米曲糖化酶活力測定方法的比較研究[J].釀酒科技，2015，161(6)：23-27.

[16] 楊麗娟，余少文.黑曲霉高產(chǎn)糖化酶的分子水平研究方法概論[J].食品研究與開發(fā)，2016，37(8)：204-208.

[17] 王海燕，秦浚川，王敖全，等.黑曲霉酸性α曲淀粉酶基因和糖化酶基因?qū)I(yè)酒精酵母的整合及其共表達[J].微生物學(xué)報，2004，44(4)：483-486.

[18] 施慧琳，孫靖淳，張榮凱，等.電子嗅在線反饋控制畢赤酵母糖化酶發(fā)酵過程中甲醇濃度新方法的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2016，36(3)：68-76.

[19] 湯 斌，錢 鵬.黑曲霉糖化酶基因在畢赤酵母中的克隆和表達[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(6)：53-56.

[20] 唐國敏，鐘麗嬋，楊開宇，等.具有糖化酶活性的工業(yè)啤酒酵母菌的構(gòu)建及其發(fā)酵特性[J].生物工程學(xué)報，1996，12(4)：489-491.