陳筑昕 綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 脂肪干細(xì)胞具有促進(jìn)組織修復(fù)再生的作用，作用機(jī)制與其旁分泌作用密不可分。外泌體是一種細(xì)胞分泌的外囊泡結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞之間通訊的新機(jī)制。近年的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞來源外泌體是干細(xì)胞旁分泌活動的一種重要方式，介導(dǎo)其促進(jìn)組織再生。外泌體的應(yīng)用為組織修復(fù)提供了一種新策略，本文對脂肪干細(xì)胞來源外泌體應(yīng)用于組織修復(fù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞經(jīng)胞吞作用形成多泡小體后，通過細(xì)胞膜融合分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的微小囊泡[1]。根據(jù)囊泡直徑大小，可將EVs分為三類：凋亡小體（＞1 000 nm）、微囊泡（100～1 000 nm）、外泌體（Exosome，30～100 nm）。 EVs可從干細(xì)胞等多種細(xì)胞中釋放，也可被多種細(xì)胞攝入，含有與母細(xì)胞相似的生物活性物質(zhì)，包括RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及完整的細(xì)胞器（如線粒體）等。其中，外泌體可參與調(diào)控機(jī)體正常生理功能和異常病理過程，被認(rèn)為是細(xì)胞之間通訊的新機(jī)制[2]。脂肪干細(xì)胞（ADSCs）具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）相似的表面標(biāo)記、基因表達(dá)譜和生物學(xué)功能[3-5]。但目前干細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確。近年來的研究表明，干細(xì)胞所發(fā)揮的組織修復(fù)與再生功能，不僅因其在損傷部位的增殖和分化，很大程度上是由其旁分泌作用實(shí)現(xiàn)的[4-5]。ADSCs可分泌直徑20～100 nm的脂質(zhì)雙層膜包裹結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞顆粒，稱為脂肪干細(xì)胞來源外泌體（Adipose stem cells derived exosome，ADSCs-exo）。ADSCs-exo與ADSCs相比，具有更多的優(yōu)勢：性質(zhì)更穩(wěn)定，易于保存，便于管理及運(yùn)輸；不含活細(xì)胞，是無細(xì)胞治療的基礎(chǔ)；生物學(xué)功能不隨時間延長而衰減；低抗原性，同種異體應(yīng)用不會引起免疫反應(yīng)[6]。

因此，目前廣泛開展了對外泌體的成分、形成機(jī)制、作用機(jī)制和功能的研究。本文將對ADSCs-exo與組織修復(fù)相關(guān)的最新研究進(jìn)展、潛在分子機(jī)制及其未來發(fā)展方向進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性及功能

外泌體是細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程形成的直徑30～100 nm、密度為1.13～1.19 g/mL的膜性脂質(zhì)囊泡，透射電鏡下觀察具有典型的“杯口狀”形態(tài)，幾乎所有細(xì)胞類型在各種生理和病理?xiàng)l件下分泌[7]，內(nèi)含有功能性蛋白質(zhì)、mRNA及microRNA等物質(zhì)，在細(xì)胞間的信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用。

研究表明，不同來源的外泌體蛋白既有共同之處也有特異性[8]。外泌體所含的共同蛋白與其形成過程有關(guān)，這些蛋白來自分泌細(xì)胞膜及高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生物膜等。有與細(xì)胞骨架組成相關(guān)的分子：四次跨膜蛋白超家族 （如CD63、CD9和 CD81），熱休克蛋白（HSP70、HSP90）等，這些蛋白在幫助外泌體進(jìn)出細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，也因?yàn)檫@些蛋白的保守型，將其作為表面標(biāo)記來鑒定體外分離得到的外泌體。在特異性方面，病理狀態(tài)下細(xì)胞釋放的外泌體與正常狀態(tài)下細(xì)胞釋放的外泌體是存在差異的[9]。研究顯示，人類免疫缺陷病毒感染后的T淋巴細(xì)胞和EB病毒感染后的B淋巴細(xì)胞釋放的外泌體內(nèi)含有病毒編碼物質(zhì)，其機(jī)制暫時未被闡明，但可能與病理狀態(tài)下細(xì)胞的高代謝活性相關(guān)[10]。

過去認(rèn)為外泌體是細(xì)胞處理的冗余細(xì)胞成分，但越來越多的研究證明，外泌體通過細(xì)胞間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的特定物質(zhì)，參與機(jī)體的各種生理或病理的過程，如抗原呈遞免疫反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移、蛋白清除、基因交換等[11-12]。外泌體進(jìn)入靶細(xì)胞的途徑有三種：通過靶細(xì)胞胞吞作用被攝入到細(xì)胞內(nèi)；通過細(xì)胞膜融合的方式與靶細(xì)胞膜融合，直接釋放其中含有的物質(zhì)及信息到靶細(xì)胞；通過膜表面與靶細(xì)胞膜表面的受體-配體高效率的結(jié)合，將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而進(jìn)行信息交流。最新研究表明，外泌體還可作為載體將抗腫瘤藥物紫杉醇包被，并靶向遞送至腫瘤細(xì)胞，從而提高化療藥物紫杉醇對耐藥腫瘤細(xì)胞的治療效果[13]，藥物經(jīng)外泌體包封后藥代動力學(xué)發(fā)生了變化，藥物在體內(nèi)的半衰期延長，毒副作用減少，治療效果得到提高[14]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在組織修復(fù)中的相關(guān)研究

外泌體不僅體現(xiàn)來源細(xì)胞的分化方向，還體現(xiàn)來源細(xì)胞的生理病理狀態(tài)，是因?yàn)槠渌膍iRNA是細(xì)胞間交流的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠通過自身的降解和再表達(dá)來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因表達(dá)。細(xì)胞中RNA的表達(dá)譜特征不具有供體和組織特異性，然而外泌體中所含的RNA卻較大程度地受細(xì)胞類型和分化狀態(tài)的影響，不同組織來源的外泌體具有不同的性能。間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 （Mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-exo）中的RNA或者蛋白能夠發(fā)揮細(xì)胞歸巢作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，可以限制損傷、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及促進(jìn)細(xì)胞損傷后的自我修復(fù)和組織再生[15-17]。Baglio等[16]分離由人骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體，并通過電子顯微鏡標(biāo)記、蛋白分析、RNA測序等方法，證實(shí)人骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體富含特異性miRNA和tRNA。Quesemberry等[18]提出，MSC-exo扮演著干細(xì)胞生物學(xué)上的關(guān)鍵角色，推測外泌體在免疫調(diào)節(jié)、促血管形成及促進(jìn)細(xì)胞新生方面有重要作用。

2.1 免疫調(diào)節(jié)

Zou等[19]發(fā)現(xiàn)，MSC-exo可降低巨噬細(xì)胞趨化蛋白CX3CL1及腫瘤壞死因子（TNF）的表達(dá)，同時上調(diào)白細(xì)胞介素-10，降低局部炎癥反應(yīng)，起到免疫調(diào)節(jié)的作用。Kordelas等[20]的研究表明，MSC-exo可降低難治性抗移植物抗宿主病患者體內(nèi)的白介素-1β、TNF-α及γ-干擾素水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，促進(jìn)受損組織修復(fù)。

2.2 促血管新生

研究證明，來自內(nèi)皮祖細(xì)胞的外泌體，攜帶有促血管生成的miRNA（如 miR-126、miR-296和let-7等），能夠在靜止的內(nèi)皮細(xì)胞中通過水平轉(zhuǎn)移RNA激活血管形成[21-22]。將MSC外泌體與血管內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)，MSC-exo可被血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取并內(nèi)化，RT-PCR發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣高表達(dá)MSC-exo攜帶的促血管化miRNA[23]。人臍帶MSC-exo與體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時，內(nèi)皮細(xì)胞成管狀結(jié)構(gòu)更加明顯，內(nèi)皮細(xì)胞遷移更加良好[24]。

2.3 促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡

在甘油誘導(dǎo)的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 （Severe combined immune deficiency，SCID）鼠急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC-exo具有保護(hù)腎功能的作用[25]，其修復(fù)能力與其母體細(xì)胞無顯著性差異，可通過上調(diào)bcl-xl、bcl2、birc8等抗凋亡基因，下調(diào)Casp1、Casp8、LTA等促凋亡基因，同時活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮組織修復(fù)作用。此外，MSC-exo可通過向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，誘導(dǎo)靶細(xì)胞合成肝細(xì)胞生長因子（HGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等，激活信號通路，調(diào)控靶細(xì)胞的細(xì)胞周期活動，最終促進(jìn)其增殖[26]。Ko等[27]的研究表明，靜脈輸注ADSCs-exo可抑制大鼠模型的肝癌細(xì)胞的生長，認(rèn)為與NKT細(xì)胞有關(guān)。但是，孫昭等[28]認(rèn)為，ADSCs-exo下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT8上皮相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，因而促進(jìn)HCT8的遷移和侵襲。在乳腺癌細(xì)胞系遷移方面，ADSCs-exo也被認(rèn)為可將Wnt信號通路激活，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系MCF7的遷移[29-30]。

3 ADSCs-exo應(yīng)用于促進(jìn)組織再生的研究進(jìn)展

近年來發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo與ADSCs分泌的生長因子、趨化因子、脂質(zhì)等多種活性物質(zhì)近似，可能也具有相似的生物活性[31-33]，可促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生。血小板衍生的生長因子可促進(jìn)ADSCs釋放增強(qiáng)血管生長潛力的外泌體[1]。

3.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復(fù)

魏俊吉等[34]用PC12細(xì)胞（鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系）建立谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，用ADSCs-exo處理損傷細(xì)胞，結(jié)果顯示外泌體中含有大量的對大腦損傷有一定保護(hù)作用的細(xì)胞因子（如胰島素生長因子和肝細(xì)胞生長因子），能夠提高損傷細(xì)胞的存活率，其作用機(jī)制可能是外泌體通過PI3K-Akt通路實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo能夠攜帶高水平的腦啡肽酶，具有治療阿爾茲海默病的潛能[35]。阿爾茲海默病一種神經(jīng)退行性病變，其特征性表現(xiàn)是β-淀粉肽在腦中沉積，腦啡肽酶是腦中最重要的β-淀粉肽降解酶。ADSCs-exo與高表達(dá)β-淀粉肽的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時，能夠降低細(xì)胞內(nèi)、外的β-淀粉肽，表明ADSCs-exo有助于β-淀粉肽的清除。此外，ADSCs-exo釋放一系列神經(jīng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子和神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子等，可促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)并刺激神經(jīng)組織再生。Chen等[36]發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo的聯(lián)合治療可減少大鼠急性缺血性卒中的梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

3.2 心臟損傷修復(fù)

Cui等[37]的報道顯示，ADSCs-exo可通過轉(zhuǎn)運(yùn)microRNA改善心肌缺血，顯著降低因心肌缺血引起的心肌梗死，同時肌酸激酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ的水平降低。同時，ADSCs-exo拮抗心肌細(xì)胞凋亡，通過Bcl-2的上調(diào)和Bax的下調(diào)，對心臟功能產(chǎn)生保護(hù)作用。

3.3 腎損傷修復(fù)

Lin等[38]應(yīng)用小鼠腎臟缺血再灌注模型，比較ADSCs、ADSCs-exo以及兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用外泌體即可減輕腎缺血再灌注損傷，兩者聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用干細(xì)胞更能減輕腎臟功能的惡化和保護(hù)腎結(jié)構(gòu)的完整性，并認(rèn)為外泌體能轉(zhuǎn)運(yùn)特殊的mRNA分子，激活A(yù)Kt及ERK信號通路，抑制凋亡基因Bax、Caspase3/7的表達(dá)并激活細(xì)胞幸存信號，使Bcl－2表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)腎臟細(xì)胞增殖。

3.4 骨組織修復(fù)

Li等[39]報告了一種新型無細(xì)胞組織工程骨的構(gòu)建和評估。他們將hADSCs的外泌體與PLGA支架結(jié)合，成功加速了小鼠顱骨缺陷的修復(fù)。他們將ADSCs-exo固定在聚多巴胺包被的PLGA/PDA支架上，研究ADSCs-exo對人骨髓干細(xì)胞的成骨、增殖和遷移能力的影響，并通過成骨誘導(dǎo)優(yōu)化其骨誘導(dǎo)作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，ADSCs-exo可以從PLGA/PDA支架上緩慢地持續(xù)釋放；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種無細(xì)胞體系顯著增強(qiáng)了骨再生，在新形成的骨組織中至少部分通過其骨誘導(dǎo)作用和促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和歸巢作用。種新型無細(xì)胞系統(tǒng)由ADSCs-exo和PLGA/PDA支架組成，為骨組織工程提供了新的研究思路，顯示了修復(fù)骨缺損的潛力。宋子珺等[40]研究了ADSCs-exo對低氧缺血情況下骨細(xì)胞凋亡的影響。缺血是造成骨細(xì)胞凋亡的主要原因，低氧缺血環(huán)境協(xié)同促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡，ADSCs-exo可有效抑制低氧缺血環(huán)境誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡，提示ADSCs-exo可以促進(jìn)骨組織修復(fù)與再生。Tofino-Vian等[41]指出，ADSCs-exo可以緩解骨關(guān)節(jié)炎的炎癥刺激。ADSCs-exo下調(diào)白介素-1β，減少了炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，對白介素-6和前列腺素E2的影響最大，可以調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激，對異常成骨細(xì)胞代謝進(jìn)行矯正，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎。

3.5 皮膚及創(chuàng)面修復(fù)

Hu等[42]發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo能夠以劑量依賴性的方式刺激成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原蛋白合成，并促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白1、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合。Kang等[43]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo通過傳遞miR-31促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成。其中的一個抗血管生成基因HIF-1，被認(rèn)定是miR-31在血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向基因。Liang等[44]研究表明，ADSCs-Exo可傳輸miR-125a到內(nèi)皮細(xì)胞，降低血管生成抑制劑DLL4的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮尖端細(xì)胞的形成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成作用。Pu等[45]認(rèn)為，ADSCs-exo對缺血再灌注損傷的修復(fù)有明顯作用，可促進(jìn)皮瓣存活并增加毛細(xì)血管的密度。

4 總結(jié)與展望

ADSCs-exo促進(jìn)組織修復(fù)和再生，主要是通過傳遞ADSCs來源或自身特異性包裝的蛋白、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等物質(zhì)，并介導(dǎo)旁分泌通路以及所需的營養(yǎng)因子和炎癥因子，使損傷組織中的細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期[46]。ADSCs-exo可以避免干細(xì)胞治療的免疫排斥、倫理問題等缺點(diǎn)，且具有高穩(wěn)定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優(yōu)勢，與單一的細(xì)胞因子比較，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能[6]。

目前，ADSCs-exo的研究尚在初期階段，還需對ADSCsexo介導(dǎo)的促進(jìn)組織再生治療機(jī)制進(jìn)行深入的研究。因此，未來對ADSCs-exo的研究將不僅僅關(guān)注其治療潛能，更應(yīng)對相關(guān)的安全性進(jìn)行評估。

總之，隨著對ADSCs-exo研究的深入，其在促進(jìn)組織再生中的應(yīng)用和機(jī)制將更清晰，在組織缺損和修復(fù)重建中具有巨大的臨床應(yīng)用前景。