鐘浩，強傳厚，齊永長，吳俊，崔海鞠，宋歡

超臨界流體色譜法拆分某一生物堿類手性化合物

鐘浩，強傳厚，齊永長，吳俊，崔海鞠，宋歡

（宣城職業(yè)技術學院護理系，安徽 宣城 242000）

目的：通過運用超臨界流體色譜法（SFC）分離獲得單一旋光的生物堿類手性化合物。方法：運用Thar analytical SFC儀器篩選出最佳的分析方法，并通過超臨界流體制備儀器Waters Thar SFC Prep80優(yōu)化方法并在堿性條件下獲得單一旋光化合物，然后通過Thar analytical SFC和Agilent1200 LC-MS對獲得的單一旋光化合物進行光學純度和化學純度的檢查。結果：運用SFC可以將該生物堿類手性化合物分離成4種同分異構體，并使化學純度和光學純度均達到99%以上。結論：SFC可以很好地分離此生物堿類手性化合物，效果較好。

超臨界流體色譜法；光學純度；化學純度；生物堿；手性

手性藥物（chiral drug）是分子立體結構和它的鏡像彼此不能夠重合的一類藥物，將互為鏡像關系而又不能重合的一對藥物結構稱為對映體（enatiomer）［1］。已知藥物中約有30%～40%是手性藥物［2］。對映體具有不同的藥動學和藥效學，使用消旋體藥物可能導致錯誤的藥動學行為和作用模式［3］。因此，如何進行手性藥物的拆分并提供單一的手性藥物，從而控制藥品生產的質量，已成為人們關注的重大課題。

目前手性拆分已從最開始的直接結晶拆分［4］、酶拆分［5］、薄層色譜法［6］發(fā)展到膜拆分、液液萃取拆分、分子印跡拆分等新型拆分法等。近年來，基于超臨界流體作為流動相具有傳質速度快，手性選擇高，分離效果好等特點而開發(fā)出來的超臨界流體色譜法（supercritical fluid chromatography，SFC）廣泛應用于手性異構體的拆分［7-8］。SFC是一種流動相溫度、壓力均高于或略低于臨界點的色譜技術［9］。超臨界流體具有氣體的低黏度和高擴散性，又兼有與液體相近的密度和溶解能力。目前，超臨界CO2因其具有效率高，對環(huán)境良好，廉價易得，后處理簡單等特點，一般使用它做SFC的流動相［10］。

SFC作為超臨界流體技術發(fā)展的一個重要分支，在色譜領域獲得了迅速發(fā)展。SFC可以快速高效地進行手性拆分，支持單一構型的藥物分子的研究。本實驗使用SFC技術對一個含有4個異構體的手性生物堿消旋體進行拆分，首先使用分析級SFC儀器篩選拆分方法，然后使用制備級SFC儀器進行拆分獲得4個單一構型的化合物，并對這4個化合物進行光學純度和化學純度的檢測。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Thar SFC Prep80、Thar analytical SFC（沃特斯科技有限公司）；Agilent1200LC-MS（安捷倫科技公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5000旋轉蒸發(fā)儀（上海博彩儀器設備有限公司）；BC-W206型旋轉蒸發(fā)儀（上海貝凱生物化工設備有限公司）；DLSB-低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科儀器設備有限公司）；布氏漏斗（上海安普科學儀器有限公司）；一次性使用無菌注射器（20 ml，常州金龍醫(yī)用塑料器械有限公司）。

1.2 試劑 手性生物堿化合物1.3 g（某公司提供）；無水乙醇、異丙醇、甲醇（制備純，上海凌峰化學試劑有限公司）；二氯甲烷（制備純，上海政創(chuàng)實業(yè)有限公司）；氨水（分析純，上海潤捷化學試劑有限公司出品）；二乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 開發(fā)實驗 色譜柱：ChiralPak AD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm），ChiralPak AS-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OJ-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm），ChiralPak AY-H（150 mm ×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OZ-H（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A：超臨界 CO2流體，B：甲醇［0.05%二乙胺（DEA）］、乙醇（0.05%DEA）、異丙醇（0.05%DEA）。檢測波長：220 nm；流速：2.4 ml/min；柱溫：35℃。

由于待分離樣品為生物堿類，為了改善化合物峰形，防止色譜峰拖尾，在醇類流動相中添加了DEA。方法開發(fā)時，先選擇分離效果較好的手性柱，再改變醇類流動相的種類進行優(yōu)化。方法初試時，B相流動相的比例為5%～40%，采集時間15 min（5%～40%，0～8 min；40%，8～11 min；5%，11～15 min）。發(fā)現該化合物在色譜柱上保留較強，無法洗脫。故在方法篩選時，除使用AD-H色譜柱時，B相比例更改為40%，采集時間10 min。由于AD-H色譜柱一般對化合物保留較強，使用AD-H時，B相比例更改為55%，流速更改為2.0 ml/min，采集時間10 min。方法開發(fā)所使用的色譜柱和流動相，見表1，共篩選18種方法。

2.2 開發(fā)結果 經過方法開發(fā)實驗篩選，最后確定合理的分析方法為：色譜柱：ChiralPak AD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.05%DEA），B相比例：55%；檢測波長：220 nm；流速：2 ml/min；柱溫：35℃。在該方法條件下，待分離樣品的4個異構體（根據保留時間的不同，按照由小到大命名為，異構體A、異構體B、異構體C、異構體D）可以達到基線分離，并且異構體D與其它3個異構體分離度很好。分離結果色譜圖見圖1。

表1 色譜分離條件

圖1 待分離化合物分析色譜圖

2.3 制備分離 由于待分離樣品中含有4個異構體，異構體A、B、C僅達到基線分離，只經過1次制備分離難以保證4個異構體都有較高的光學純度。異構體D與其它3個異構體分離度較好，制備時經過一次制備分離得到光學純度較高的異構體D。然后改用粒徑較小的色譜柱，降低流動相流速和B相比例，改善異構體A、B、C的分離度，經過二次制備得到光學純度較高的異構體A、B、C。

2.3.1 一次制備 儀器：Thar 80制備型SFC；色譜柱：ChiralPak AD-H（300 mm×30 mm，20 μm）；流動相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.2%DEA）；B相比例：55%；流速：80 ml/min；柱溫：38℃；樣品溶解：超聲溶解于乙醇，濃度：13 mg/ml，進樣量：3.5 ml/針。制備結束后，將收集的組分在旋轉蒸發(fā)儀上于40℃水浴上旋干，得到異構體A、B、C的混合物以及單一的異構體D，見圖2、圖3。

圖2 第一次分離單一進樣分離色譜圖

圖3 第一次分離連續(xù)進樣分離色譜圖

2.3.2 二次制備 儀器：Thar 80制備型SFC；色譜柱：ChiralPak AD-H（300 mm×30 mm，20 μm），流動相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.2%DEA），B相比例：40%；流速：65 ml/min；柱溫：38℃。樣品溶解：超聲溶解于乙醇，濃度：10 mg/ml，進樣量：3 ml/針。制備結束后，將收集的組分在旋轉蒸發(fā)儀上于40℃水浴上旋干，即分別得到單一的異構體A、B、C。見圖4、圖5。

圖4 第二次分離單一進樣分離色譜圖

圖5 第二次分離連續(xù)進樣分離色譜圖

2.4 質量控制

2.4.1 光學純度測定 經過2次制備后得到的4個單一異構體的光學純度的測定采用2.2中所述色譜條件，測定結果見圖6。

圖6 4個單一異構體的光學純度

2.4.2 化學純度測定 經過2次制備后得到的4個單一異構體的化學純度的測定使用Agilent 1200 LC-MS，測定結果見圖7。LC-MS條件：色譜柱：Xtimate C18（2.1 mm×30 mm，3μm）；流動相：A：水（0.1%三氟乙酸），B：乙腈（0.1%三氟乙酸）；流速：1 ml/min；柱溫：50℃。

圖7 4個單一異構體的化學純度

3 討論

本實驗進行手性分離的化合物是生物堿，堿性化合物在色譜柱上的峰形經常出現拖尾現象，這是由于色譜柱殘留的硅羥基和帶正電荷的堿性化合物之間的相互作用引起的。實驗中，在流動相中添加了DEA以減少堿性化合物的峰拖尾。DEA相當于競爭物，占據硅羥基的位置，用于消除化合物與殘留硅羥基間的相互作用，使色譜柱鈍化，改善化合物峰形。

在建立化合物的手性分離方法時，一般首先選擇分離效果最好的手性柱，然后再繼續(xù)優(yōu)化分析條件，可以改變改良劑的種類，降低改良劑的比例，降低流動相的流速。多數情況下，降低改良劑的比例和流動相的流速可以改善分離度，但會延長化合物的保留時間。在實驗的二次制備中，為了改善異構體A、B、C的分離度，降低了乙醇的比例和流動相的流速。本實驗中進行了2次制備分離，改變的是流動相的比例和流速，得到了4個單一構型的化合物。在其它分離含有多個手性中心的化合物的情況中，也可以根據方法開發(fā)情況結合使用不同的色譜柱和改良劑進行制備分離。

在實驗樣品制備分離過程中溫度對分離效果會產生影響，注意控制循環(huán)水浴的溫度，防止由于溫度的變化引起的分離度的變化。

綜上所述，本實驗使用SFC技術對一個含有4個異構體的手性生物堿消旋體進行了拆分，對得到的4個單一化合物進行了光學純度和化學純度的檢測，均獲得了較高的光學純度和化學純度?？梢奡FC方法在這一手性生物堿的手性分離過程中有很好的效果，且在分離過程中對于堿性化合物可以使用固體填料致純的方法能夠獲得更加的分離效果，為以后生物堿類化合物的手性分離提供了實驗方法依據。

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Separation of An Alkaloids of Chiral Compound by Using Supercritical Fluid Chromatography

ZHONG Hao，QIANG Chuanhou，QI Yongchang，WU Jun，CUI Haiju，SONG Huan
（Nursing Department，Xuancheng Vocational and Technical College，Xuancheng 242000，China）

Objective：To separate an alkaloids of chiral monomers by using supercritical fluid chromatography（SFC）.Methods：The best analytical method was obtained by Thar analytical SFC，and then Waters Thar SFC Prep80 was used to separate the alkaloid.The chemical purity and optical purity of chiral monomers were analyzed by Thar analytical SFC and Agilent1200 LC-MS.Result：The chiral monomers were separated by SFC and the chemical purity and optical purity were all over 99%.Conculusion：SFC is a wonderful technique to separate the alkaloid with good effect.

supercritical fluid chromatography；chemical purity；optical purity；alkaloid；chiral

R917

A

1008-2344（2017）06-0498-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.012

2017-04-10

（文敏編輯）