孫瑋璐，韓翰

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)12班，遼寧 沈陽 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）

SAHA-CTSB對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

孫瑋璐1，韓翰2*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)12班，遼寧 沈陽 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）

目的：探討辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）是否經(jīng)由組織蛋白酶B（CTSB）的有效調(diào)控誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的發(fā)生。方法：采用Western blot及ELISA法檢測(cè)SAHA、CTSB抑制劑（Cystain C）對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CTSB表達(dá)的影響；采用Muse自動(dòng)分析儀檢測(cè)SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力及凋亡的影響。結(jié)果：Cystatin C對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CTSB的有效抑制濃度為100 ng/ml；Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細(xì)胞后，乳腺癌細(xì)胞活力及凋亡細(xì)胞比率較單獨(dú)SAHA處理組相比恢復(fù)明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：SAHA對(duì)乳腺癌的生長抑制作用需要CTSB的參與。

活乳腺癌；SAHA；CTSB；凋亡

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤［1-2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在過去的20年中，全球乳腺癌絕對(duì)數(shù)量上升了1.4倍，我國每年新發(fā)女性乳腺癌病例約27.9萬，位居女性發(fā)病首位，且三陰乳腺癌發(fā)病比例越來越大［3-4］。目前，乳腺癌的治療仍以手術(shù)為主，輔助放療和化療，雖然有一定的療效，但仍存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)和普遍的耐藥現(xiàn)象［5-6］。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）作為抗腫瘤藥物為探索女性惡性腫瘤治療提供了新方向［7-9］。辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是目前已知最經(jīng)典的HDACi之一，研究表明，SAHA對(duì)乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等均有高效殺傷作用，并且不良反應(yīng)較少［10-12］。

組織蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）是溶酶體內(nèi)半胱氨酸組織蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族，其廣泛地參與蛋白質(zhì)的降解，并在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［13-14］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系［15-16］。

研究表明，SAHA可通過影響乳腺癌細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞增殖［17-19］，但其全部作用靶點(diǎn)并沒有闡明，因此，有針對(duì)性地篩選出SAHA作用的新效應(yīng)靶點(diǎn)是十分必要的。本文選取三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，探討SAHA是否經(jīng)由CTSB的有效調(diào)控，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長增殖。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自美國ATCC細(xì)胞庫；Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA、CTSB抑制劑（Cystain C）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Muse Annexin V&Dead Cell、Muse Count&Viability試劑盒購自德國Merck Millipore公司；Human Pro-Cathepsin B ELISA試劑盒購自美國R&D公司；其他的化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含15%胎牛血清的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基（含100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素），37℃、5%CO2的條件下傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CTSB的影響 將5×105個(gè)/ml的MDAMB-231細(xì)胞接種于6孔板各孔內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿率＞75%進(jìn)行L-15無血清同步化處理后，加入5 μmol/L的SAHA與不同濃度的CTSB抑制劑Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后，采用RIPA蛋白裂解液提取出的蛋白應(yīng)用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定，調(diào)整蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜。TBST沖洗10 min，3次，將膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗中，室溫中搖床振蕩60 min，用TBST洗膜10 min，3次，將等體積混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光后，計(jì)算膜上各抗體標(biāo)記點(diǎn)的灰度值。

1.2.3 ELISA檢測(cè)SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CTSB表達(dá)量的影響 將5×105個(gè)/ml的MDAMB-231細(xì)胞接種于6孔板各孔內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿率＞75%進(jìn)行L-15無血清同步化處理后，加入5 μmol/L的SAHA與不同濃度的CTSB抑制劑Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培養(yǎng)48 h，加入裂解液進(jìn)行裂解后，經(jīng)酶標(biāo)抗體孵育、底物顯色處理，在450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定SAHA和Cystain C各處理組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CTSB蛋白表達(dá)的影響。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 將5×105個(gè)/ml乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞分別接種于6孔板各孔中，待細(xì)胞鋪滿率＞75%進(jìn)行無血清同步化處理。MDA-MB-231細(xì)胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105個(gè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和450 μl Count&Viability試劑共同孵育5 min。通過Muse自動(dòng)細(xì)胞分析儀（德國MerckMillipore公司）Cell Count&Viability software module分析各處理因素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞活力發(fā)生的情況。1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將5×105個(gè)/ml乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞分別接種于6孔板各孔中，待細(xì)胞鋪滿率＞75%進(jìn)行無血清同步化處理。MDA-MB-231細(xì)胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105個(gè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和100 μl Muse Annexin V＆Dead Cell試劑室溫孵育20 min。應(yīng)用自動(dòng)細(xì)胞分析儀Muse Cell Analyzer檢測(cè)各處理因素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，2組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CTSB的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，SAHA能夠顯著增加乳腺癌細(xì)胞中CTSB的蛋白含量，當(dāng)加入CTSB特異性抑制劑Cystain C后，發(fā)現(xiàn)Cystain C對(duì)SAHA引起的CTSB表達(dá)升高具有不同抑制作用，僅Cystain C濃度達(dá)到100 ng/ml抑制作用達(dá)到最強(qiáng)，與SAHA+0 ng/ml Cystatin C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中CTSB表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果也驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白對(duì)照組相比，SAHA可顯著升高乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中CTSB的相對(duì)表達(dá)量。低濃度的Cystatin C不能有效地抑制SAHA引起的CTSB相對(duì)表達(dá)量的升高，只有濃度達(dá)到100 ng/ml時(shí)，CTSB的相對(duì)表達(dá)量才有所下降，且與SAHA+0 ng/ml Cystatin C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 ELISA檢測(cè)SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231中CTSB表達(dá)的影響

2.2 SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響 為明確CTSB在SAHA抑制乳腺癌細(xì)胞生長過程中的作用，將100 ng/ml Cystain C作用于MDAMB-231細(xì)胞中以抑制CTSB的表達(dá)，分析SAHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)SAHA能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，活細(xì)胞比率下降（P＜0.05）；單獨(dú)Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞影響不大，細(xì)胞活力無明顯的變化；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細(xì)胞后，乳腺癌細(xì)胞活力較單獨(dú)SAHA處理組相比恢復(fù)明顯，MDA-MB-231活細(xì)胞比率高于單獨(dú)SAHA處理組（P＜0.05），見圖3。

圖3 Muse自動(dòng)細(xì)胞分析儀分析SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響（*P＜0.05）

2.3 SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：單獨(dú)SAHA能夠顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，凋亡細(xì)胞（含早、晚期凋亡）和死細(xì)胞比率升高（P＜0.05）；單獨(dú)Cystain C作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后凋亡細(xì)胞（含早、晚期凋亡）和死細(xì)胞比率與空白對(duì)照組相比相差不大；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌細(xì)胞后，乳腺癌MDA-MB-231凋亡細(xì)胞（含早、晚期凋亡）和死細(xì)胞比率較SAHA組下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 Muse自動(dòng)細(xì)胞細(xì)胞儀分析SAHA、Cystain C對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響（*P＜0.05）

3 討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度程序化的主動(dòng)過程，由一系列相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控［20］。在機(jī)體發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡在組織和器官的構(gòu)建中起著重要的作用，是通過啟動(dòng)細(xì)胞自身的內(nèi)部死亡機(jī)制而產(chǎn)生的一種細(xì)胞死亡方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多抗腫瘤藥物的作用機(jī)制之一［21］。

前期研究確定了5 μmol/L SAHA作用三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48 h后可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長［11］，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L的SAHA可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞活力下降，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Western blot和ELISA等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAHA作用乳腺癌細(xì)胞過程中伴隨著CTSB蛋白表達(dá)量的增高。CTSB可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)其他蛋白酶的表達(dá)，與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系［15-16］。SAHA是否通過調(diào)控細(xì)胞中CTSB的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生目前還無法確定。我們利用CTSB特異性抑制劑Cystain C阻斷乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞中CTSB的表達(dá)，檢測(cè)CTSB在SAHA抑制乳腺癌細(xì)胞生長中的調(diào)控作用。

本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)Cystatin C濃度達(dá)到100 ng/ml時(shí)，能夠顯著抑制SAHA引起的乳腺癌細(xì)胞中CTSB的升高，ELISA證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。接下來，我們將篩選出的Cystain C、SAHA作用于MDA-MB-231細(xì)胞中，分別分析了乳腺癌細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的變化情況。發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用Cystain C抑制乳腺癌細(xì)胞中CTSB的表達(dá)時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞影響不大，細(xì)胞活力及凋亡無明顯的變化，說明CTSB功能失活對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長增殖沒有明顯調(diào)控作用，同時(shí)也表明Cystain C不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，可以作為本實(shí)驗(yàn)中獨(dú)立因素抑制MDA-MB-231細(xì)胞中CTSB的表達(dá)；而單獨(dú)SAHA處理顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長，表現(xiàn)為細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡細(xì)胞（含早、晚期凋亡）和死細(xì)胞比率明顯上升；用Cystain C抑制CTSB的表達(dá)后，SAHA處理的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的活細(xì)胞比率較SAHA單獨(dú)處理組升高，而凋亡細(xì)胞（含早、晚期凋亡）和死細(xì)胞比率較SAHA單獨(dú)處理組降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制細(xì)胞中CTSB的表達(dá)能夠明顯阻抑SAHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)，因此，SAHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用需要CTSB的調(diào)控。

綜上所述，SAHA的抗腫瘤作用雖已被證實(shí)，但其全部作用靶點(diǎn)并未完全闡明。而本研究初步闡明了SAHA經(jīng)CTSB介導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，從而抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長增殖。

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SAHA Induces Apoptosis in Triple-negative Breast Cancer Cell MDA-MB-231 via the Regulation of CathepsinB

SUN Weilu1，HAN Han2*
（1.Class 12 Grade 2015，Shenyang Medical College Shenyang 110034，China；2.Department of Biochemistry）

Objective：To clarify the regulation role of cathepsin B （CTSB） in cell apoptosis induced by SAHA in triplenegative breast cancer cell MDA-MB-231.Methods：MDA-MB-231 cells were incubated with SAHA and/or Cystain C，the expression of CTSB was determined by Western blot and ELISA，the cell viability and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by Muse cell analyzer.Results：The optimal concentration of Cystain C was 100 ng/ml.The cell viability and apoptosis test demonstrated that the combination treatment of Cystatin C and SAHA significantly resumed the inhibitory effect caused by SAHA alone.Conclusion：CTSB plays an important role in apoptosis induced by SAHA in triple-negative breast cancer cell MDA-MB-231.

breast cancer；SAHA；CTSB；apoptosis

R725

A

1008-2344（2017）06-0530-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.021

沈陽醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（No.20141004）；沈陽醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研課題（No.20179002）

韓翰（1982—），女（漢），講師，研究方向：腫瘤分子機(jī)制研究.E-mail：hanhan82831@163.com

2017-07-07

（文敏編輯）