潘家坪，阮井玲，黃媚媛，王羽，梁珊珊，滕曉明，吳海霞

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 201202)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum，ER)是一種在進(jìn)化上高度特化的細(xì)胞器，調(diào)控蛋白的合成、折疊、修飾以及分泌蛋白和膜表面蛋白的轉(zhuǎn)運(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))。作為細(xì)胞內(nèi)最重要的Ca2+儲存細(xì)胞器，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Smooth Endoplasmic Reticulum，SER)對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+自穩(wěn)發(fā)揮著重要的作用[1-2]，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對受精過程中卵母細(xì)胞活化亦發(fā)揮著重要作用[3-4]。

卵母細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集(Smooth Endoplasmic Reticulum Aggregates，SERa)是卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種異?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體，干擾Ca2+震蕩從而影響卵母細(xì)胞受精[5]，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育和胚胎種植。Shaw-Jackson等[6]研究發(fā)現(xiàn)，體外受精行促排卵患者中10%周期出現(xiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，而19%～34%卵母細(xì)胞可出現(xiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集。已有研究證實卵母細(xì)胞出現(xiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集可導(dǎo)致受精、胚胎發(fā)育異常，妊娠率降低以及出現(xiàn)新生兒異常[3,7]。由于SERa+卵母細(xì)胞來源的胚胎移植后異常妊娠結(jié)局顯著增加，2011年ESHR會議伊斯坦布爾共識不推薦移植SERa+胚胎[8]，然而其他研究發(fā)現(xiàn)SREa+胚胎移植后可分娩正常健康的新生兒[9-10]。本研究就卵母細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集對卵母細(xì)胞利用率的影響進(jìn)行回顧性分析。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2013年1月至2014年12月在同濟(jì)大學(xué)附屬上海第一婦嬰保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI-ET助孕治療患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)受精方式為ICSI；(2)新鮮取卵周期；(3)卵裂期胚胎。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)IVF-ET；(2)冷凍卵母細(xì)胞；(3)凍融胚胎移植周期；(4)睪丸穿刺取精或副睪穿刺取精；(5)植入前遺傳學(xué)診斷或篩查。

根據(jù)卵母細(xì)胞有無SERa分為兩組：A組：SERa陽性組(至少有1個卵母細(xì)胞SERa+)50周期，共414個MII卵母細(xì)胞，其中包括111個SERa+卵母細(xì)胞及303個SERa-卵母細(xì)胞；B組：SERa陰性組(所有卵母細(xì)胞均無SER聚集)200周期，共1 390個MII卵母細(xì)胞。

所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.卵母細(xì)胞SERa：在輔助生殖的體外授精I(xiàn)CSI過程中，將包繞顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞拆除后觀察，發(fā)現(xiàn)有一部分異常卵母細(xì)胞的存在，在高倍鏡下(×400)可見該卵母細(xì)胞帶有一個甚至多個折光體，該折光體稱為囊。卵母細(xì)胞內(nèi)的囊由膜包裹，內(nèi)為液體，液體成分通常與透明帶下間隙內(nèi)液體成分一致，由滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合而成[11](圖1)。此囊性結(jié)構(gòu)其實就是滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集(SERa)。

2. ICSI及胚胎評分：ICSI后的卵細(xì)胞在卵裂培養(yǎng)液中培養(yǎng)大約16 h后，觀察2PN情況，約68 h后觀察受精卵有無卵裂并且對胚胎進(jìn)行評分：卵裂球大小均勻，無碎片為Ⅰ級胚胎；卵裂球大小均勻，碎片<25%為Ⅱ級胚胎；卵裂球大小不均勻，無碎片為Ⅲ胚胎；卵裂球大小不均勻，碎片<25%為Ⅳ胚胎；卵裂球大小均勻或不均勻，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量碎片為Ⅴ胚胎；卵裂球分辨不清，且胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量碎片為Ⅵ胚胎。Ⅰ～Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ～Ⅳ級胚胎為可利用胚胎，Ⅴ及Ⅵ級胚胎因胚胎質(zhì)量差或被丟棄。

A：SERa+卵母細(xì)胞(箭頭示SERa)；B：正常卵母細(xì)胞圖1 拆除顆粒細(xì)胞后的卵母細(xì)胞光鏡下形態(tài)(×400)

3.主要觀測指標(biāo)：MII卵率以MII卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%計算；受精率以受精數(shù)/MII卵母細(xì)胞數(shù)×100%計算；異常受精率以異常受精卵母細(xì)胞數(shù)(>2PN)/MII卵數(shù)×100%計算；卵裂率以卵裂胚胎數(shù)/受精數(shù)×100%計算；有效胚胎形成率以可用卵裂期胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%計算；卵母細(xì)胞利用率以可用卵裂期胚胎數(shù)/MII卵數(shù)×100%計算。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

本研究共納入250個周期239例患者1 804個成熟卵母細(xì)胞。其中A組50周期49例患者414個成熟卵母細(xì)胞，包括111個SERa+卵母細(xì)胞及303個SERa-卵母細(xì)胞；B組200周期190例患者1 390個成熟SERa-卵母細(xì)胞。

兩組患者年齡、BMI、不孕時間、基礎(chǔ)FSH等方面比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩組患者COS方案、Gn用量、促排時間及HCG日血E2水平相比亦均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者卵母細(xì)胞利用率比較

與B組相比，A組成熟卵母細(xì)胞率顯著增加(P<0.01)，卵母細(xì)胞受精后卵裂率、有效胚胎形成率及卵母細(xì)胞利用率顯著降低(P<0.05)，異常受精率顯著增加(P<0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般情況比較[(-±s)，%]

注：與B組比較，*P<0.05

表2 兩組患者卵母細(xì)胞利用率比較(%)

注：獲卵均數(shù)不符合正態(tài)分布，所以用秩和檢驗；與B組比較，*P<0.05，#P<0.01

三、A組中SERa-卵母細(xì)胞與B組SERa-卵母細(xì)胞的利用率比較

同樣我們的研究提示，A組中的SERa-卵母細(xì)胞成熟率、異常受精率均顯著高于B組SERa-卵母細(xì)胞，而受精后的卵裂率、有效胚胎形成率及卵母細(xì)胞利用率均顯著低于B組(P<0.05)(表3)。

四、A組中SERa-卵母細(xì)胞與A組SERa+卵母細(xì)胞的利用率比較

除了SERa+卵母細(xì)胞異常受精率顯著增加(P<0.05)外，兩種卵母細(xì)胞成熟率，受精率、卵裂率、有效胚胎形成率及卵母細(xì)胞利用率均無顯著性差異(均P>0.05)(表4)。

表3 A組中SERa-卵母細(xì)胞與B組SERa-卵母細(xì)胞的利用率比較(%)

注：A組SERa-卵母細(xì)胞與B組SERa-卵母細(xì)胞比較，*P<0.05

表4 A組中SERa+卵母細(xì)胞與SERa-卵母細(xì)胞的利用率比較(%)

注：與SERa-卵母細(xì)胞比較，*P<0.05

討 論

卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)SERa的出現(xiàn)可能歸因于卵巢過度刺激[12]，目前研究證實SERa往往出現(xiàn)于Gn用量多時間長的周期[7，13]。Setti等[14]進(jìn)行了預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)母體年齡，F(xiàn)SH用量及HCG日血E2水平與SERa的出現(xiàn)無關(guān)，然而卵泡數(shù)目及獲卵數(shù)目顯著增加了卵母細(xì)胞SERa的風(fēng)險。SERa可影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+震蕩從而影響卵母細(xì)胞受精[5]，我們的研究發(fā)現(xiàn)SERa+周期無論是SERa+卵母細(xì)胞還是SERa-卵母細(xì)胞，亦或者是SERa+周期與SERa-周期相比，其受精率顯著降低，而異常受精率顯著增加，可能與卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集干擾受精過程中Ca2+自穩(wěn)和震蕩相關(guān)，這與其他研究者的發(fā)現(xiàn)相一致。

Braga等[15]研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)SERa可使囊胚形成率降低35%左右，妊娠率降低67%而流產(chǎn)率增加20%，然而Setti等[14]研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)SERa不影響受精、卵裂期胚胎質(zhì)量及囊胚形成，但顯著降低種植率。我們的研究發(fā)現(xiàn)SERa+周期無論是SERa+卵母細(xì)胞還是SERa-卵母細(xì)胞，卵裂期有效胚胎形成率及卵母細(xì)胞利用率均顯著降低。Setti等[14]的研究對象主要為黃體期長方案促排卵的患者，而我們的研究納入了所有控制性卵巢刺激方案的患者，這種不同的納入標(biāo)準(zhǔn)可能導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。由于SERa+的胚胎不作為首選移植胚胎，許多SERa+胚胎都沒有機(jī)會被移植，僅少部分該類胚胎被移植，所以我們的研究只能以MII卵母細(xì)胞有效胚胎形成率作為最終觀察指標(biāo)，而不能以妊娠率或者是種植率等其他更直接的指標(biāo)作為觀察指標(biāo)。所以本研究的意義可能受到限制，今后或可做某些進(jìn)一步工作。

在體外培養(yǎng)過程中，溫度、培養(yǎng)液pH值變化以及高氧環(huán)境均可影響植入前胚胎的發(fā)育，這些理化因素的改變激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)對機(jī)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞代謝、蛋白表達(dá)自穩(wěn)，卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，可能與線粒體相互作用，干擾胚胎發(fā)育過程的能量代謝及基因表達(dá)，從而導(dǎo)致有效胚胎形成率降低及卵母細(xì)胞利用率低下。仍需進(jìn)一步研究，實驗室動物模型研究闡明滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集影響ICSI胚胎質(zhì)量的分子機(jī)制。

在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn)SERa陽性周期中即使是SERa-卵母細(xì)胞其受精率、有效胚胎形成率及利用率均顯著低于SERa陰性周期的卵母細(xì)胞，Otsuki等[16]研究證實SERa+周期中普通光學(xué)顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)SERa的卵母細(xì)胞在電子顯微鏡下可看到SERa，表明在SERa+周期內(nèi)，即使卵母細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡下未看到SERa，但實際上這些卵母細(xì)胞中還是存在極小的SERa，其大小往往在2～9 μm左右，因此我們研究中SERa+周期中SERa-卵母細(xì)胞利用率低下可能是因為普通光學(xué)顯微鏡未發(fā)現(xiàn)的極小SERa所致。

我們的研究還比較了SERa+周期中SERa+卵母細(xì)胞及SERa-卵母細(xì)胞利用率的差別，我們發(fā)現(xiàn)除了SERa+卵母細(xì)胞異常受精率顯著增加外，受精率、卵裂期有效胚胎形成率及卵母細(xì)胞利用率無顯著性差異，這可能與極小的電子顯微鏡下可見的SERa有關(guān)。在我們的研究中我們還發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)SERa的卵母細(xì)胞成熟度顯著增加，這與Setti等[14]的研究相一致，目前還需進(jìn)一步通過動物實驗來闡明這種SERa+卵母細(xì)胞高成熟度的分子機(jī)制。

總之，本研究證實卵母細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集可顯著降低受精率、有效胚胎形成率進(jìn)而影響卵母細(xì)胞利用率。因此，對于ICSI術(shù)中仔細(xì)觀察卵母細(xì)胞有無滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集對指導(dǎo)胚胎移植策略重要的意義。我們的研究尚存在不足，樣本數(shù)量太少，未涉及SERa+胚胎移植結(jié)局，因此還需大樣本多中心的研究證實我們的研究結(jié)果。

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