李雪瑤，楊菁，李潔，徐玲

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

夫妻正常無保護性性生活同居一年未孕為不孕癥或不育癥，全球約10%～15%的夫妻受此困擾，男性因素不孕與女性因素不孕幾乎各占一半。全球有約5%的男性有不育癥，隨著研究的深入，越來越多的因素被證明與男性不育相關(guān)，生精過程極為復(fù)雜，任一環(huán)節(jié)的障礙都可以導(dǎo)致男性不育。本文主要討論piRNA通路在生精過程中的作用。

一、piRNA簡介

非編碼RNA(non-coding RNA)是一類通常被認(rèn)為不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括小分子非編碼RNA(small non-coding RNA，sncRNA)與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，licRNA)。小分子非編碼RNA又包括siRNA(small interfering RNA)、snoRNA(small nucleolar RNA)、miRNA(micro RNA)、tRNA(transfer RNA)以及piRNA(piwi-interacting RNA)等。piRNAs是一類與Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白特異性結(jié)合的非編碼小RNA，它們與PIWI蛋白結(jié)合后，形成piRNA沉默復(fù)合體(piRNA-induced silencing complex，piRISC)在干細(xì)胞、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，特別是在生殖系統(tǒng)。

1. piRNA的發(fā)現(xiàn)與合成：piRNA是一類由Vagin等[1]最先從小鼠、大鼠的生殖細(xì)胞中分離得到的長約26～31 nt的sncRNA，因與PIWI蛋白家族成員特異性結(jié)合，稱之為PIWI-interacting RNA，即piRNA。目前在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)24 000個以上piRNA序列[2]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在牛的卵泡池與合子池中存在大量與piRNA類似但是稍短(24～27 nt)的RNA，而且表現(xiàn)出經(jīng)典的piRNA特征，稱之為pilRNA[3]。

與miRNA、siRNA不同，piRNA的生成不需要Dicer酶的存在，但Squash與Zucchini兩種核酸酶的基因突變后piRNA的合成受到影響，推測可能與這兩種酶有關(guān)[4]。編碼piRNA的基因呈高度不連續(xù)簇狀分布，因此被稱為piRNA基因簇，分單鏈簇或雙鏈簇，單鏈簇直接以本體為模板產(chǎn)生piRNA，主要存在于體細(xì)胞中；雙鏈簇則需要乒乓循環(huán)機制，產(chǎn)生正義piRNA與反義piRNA，是生殖細(xì)胞piRNA合成的主要模式[5]。piRNA簇由RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RNA pol II)轉(zhuǎn)錄，雙鏈piRNA簇由一種基因沉默與染色質(zhì)形成中的標(biāo)志物H3K9me3標(biāo)記[6]。

最廣為接受的piRNA擴增模型為乒乓循環(huán)模型(ping-pong model)，即擴增模型，又稱二次加工，解釋了piRNA從其前體循環(huán)增生，由Aubergine(Aub)與Ago3二者參與剪切[5]，主要為Aub蛋白與反義鏈piRNA結(jié)合后，通過堿基互補配對形成次級piRNA(正義鏈piRNA)前體，由具有Slicer活性的Aub進(jìn)行剪切形成次級piRNA，次級piRNA與Ago3蛋白結(jié)合，以此為模板，再合成并形成反義鏈piRNA前體，剪切產(chǎn)生成熟反義鏈piRNA，再與Aub蛋白結(jié)合，如此循環(huán)往復(fù)。Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)，小鼠睪丸生精細(xì)胞減數(shù)分裂粗線期產(chǎn)生的核蛋白BTBD18，點狀分布于細(xì)胞核內(nèi)，通過促進(jìn)RNA polymerase II的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)節(jié)小鼠piRNA簇，在沉默了BTBD18后，小鼠的piRNA合成以及生精過程受到影響，導(dǎo)致雄性不育。Wasik等[8]發(fā)現(xiàn)一種TURDs蛋白RNF17可抑制次級piRNA的擴增，從而引發(fā)小鼠不育。

還有一種途徑為初級加工途徑，線粒體外膜蛋白GPAT2通過與Mili結(jié)合參與初級piRNA的合成[9]。MitoPLD被認(rèn)為參與了piRNA 5’末端甚至3’末端的加工成熟[10]，洪葉挺[11]發(fā)現(xiàn)，弱精癥、無精癥患者精漿中piRNA的種類和含量較正常男性明顯減少，并且伴有MitoPLD蛋白表達(dá)的下降，而MitoPLD缺失突變的小鼠生精過程被阻滯在減數(shù)分裂偶線期，他們推測MitoPLD蛋白可影響piRNA的形成，并且他們通過電鏡證明，精漿piRNA大部分存在于Exosome中。piRNA的5’末端具有很強的尿嘧啶偏向性，3’末端被2’-O-Me修飾，以免受核酸外切酶降解[12]。

2. PIWI蛋白：果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有5種不同的Argonaute蛋白(Ago1、Ago2、Ago3、Piwi和Aub)，其中Ago3與Aub同屬于PIWI亞家族，具剪切活性。哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有Miwi/Piwi、Mili/Piwi2和Miwi2/Piwil4 3種PIWI亞家族，人類已經(jīng)確定的有Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4四種PIWI亞家族[13]。piRNA主要通過piRISC即piRNA通路在哺乳動物精子形成中發(fā)揮重要作用，缺少PIWI蛋白的動物表現(xiàn)為雄性不育。比如，小鼠敲除Miwi、Mili或Miwi2基因后，精子表現(xiàn)出明顯缺陷[14]，敲除了雌性小鼠Mili基因后，幾乎所有piRNA都消失了，并且伴有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的大量表達(dá)，而敲除Miwi后對其影響較小[15]，說明Piwi蛋白的異常表達(dá)，主要對男性生精功能造成影響。

PIWI蛋白的表達(dá)具有時間與空間上的差異[16]。小鼠體內(nèi)的Mili蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)中，特別是細(xì)胞核周圍的nuage中[17]，在生殖干細(xì)胞時期開始表達(dá)，在精原干細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的細(xì)線前期與細(xì)線期明顯減少，在減數(shù)分裂偶線期開始表達(dá)增多，在減數(shù)分裂粗線期達(dá)到高峰；Miwi蛋白主要在核糖核蛋白和多聚核糖體上表達(dá)，主要出現(xiàn)在減數(shù)分裂粗線期直至早期圓形精子細(xì)胞時期，之后將被泛素化修飾清除[18]；Miwi2則表達(dá)于減數(shù)分裂的粗線前期細(xì)胞核上，呈一過性，但是Miwi2蛋白的突變會導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征(Sertoli cell only syndrome，SCOS)[19]。

二、piRNA通路在生精過程中的作用

1.抑制轉(zhuǎn)座子：piRNA下游通路蛋白Exonuclease domain-containing1(EXD1)和CG9754可以抑制轉(zhuǎn)座子活化、激活轉(zhuǎn)座子高甲基化及促進(jìn)轉(zhuǎn)錄沉默[20]。TDRD12是Tudor結(jié)構(gòu)域家族(Tudor domain containing)成員，EXD1是TDRD12的一個重要組成部分，在睪丸中表達(dá)水平最高[21]，作為下游通路蛋白，可以輔助調(diào)節(jié)piRNA抑制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的發(fā)生；缺乏EXD1會引起反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的增多以及活化轉(zhuǎn)座子。研究發(fā)現(xiàn)，CG9754是轉(zhuǎn)座子抑制和轉(zhuǎn)錄沉默中重要的piRNA通路蛋白，CG9754同RNA或DNA的結(jié)合可以引起有效的轉(zhuǎn)錄沉默。很多證據(jù)表明，轉(zhuǎn)座子的調(diào)控與生精過程密切相關(guān)，主要促進(jìn)宿主基因組產(chǎn)生重要的物質(zhì)來保護遺傳信息，在動物模型中，如果該動物中PIWI通路異常，則表現(xiàn)為雄性不育，這也進(jìn)一步證實了該通路與生精過程相關(guān)[22-23]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Mili通過切割細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶RNA來阻止piRNA與細(xì)胞核內(nèi)Miwi2結(jié)合，Mili剪切后產(chǎn)生一個piRNA前體的中間體，該中間體轉(zhuǎn)化加工為piRNA依靠MVH(Mouse Vasa Homolog)的ATP酶活性，以此來保證轉(zhuǎn)座子的沉默與維持雄性生育力，而TDRD9的ATP酶活性對于piRNA的生物合成是不必要的，但是對于轉(zhuǎn)座子的沉默與男性生育力的維持卻是必不可少的[24]。另有實驗證明，Cbp80參與piRNA的合成，敲低小鼠的Cbp80后發(fā)現(xiàn)Piwi、Aub、Ago3蛋白下降以及定位的改變，并伴有轉(zhuǎn)座子的上調(diào)[25]。

2.介導(dǎo)泛素化降解：Gou等[18]發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)Piwi蛋白泛素化降解的關(guān)鍵元件D-box(Destruction box)的雜合突變會導(dǎo)致患者弱精癥、甚至無精癥，通過將Piwi(Miwi)雜合突變敲入小鼠進(jìn)行建模驗證，發(fā)現(xiàn)Miwi/D-box雜合突變小鼠均出現(xiàn)雄性不育，其生精過程停滯在延長型精子細(xì)胞階段，僅部分小鼠可產(chǎn)生少量形態(tài)異常的精子，與這些患者表型一致。正常情況下，組蛋白泛素連接酶RNF8與Miwi蛋白以不依賴piRNA的方式相互作用，Miwi蛋白將在晚期精子細(xì)胞中被泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化通路降解，使RNF8進(jìn)入細(xì)胞核泛素化修飾組蛋白，啟動組蛋白-魚精蛋白交換。而在這些雜合突變的小鼠中，Miwi在晚期精子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中與RNF8穩(wěn)定螯合、持續(xù)存在，造成本應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞核的RNF8繼續(xù)留在細(xì)胞質(zhì)，因此抑制了組蛋白的修飾及組蛋白-魚精蛋白交換的啟動，導(dǎo)致組蛋白大量滯留，最終造成嚴(yán)重的雄性不育；但是將RNF8-N端多肽導(dǎo)入精子細(xì)胞可提高精子數(shù)量與質(zhì)量、改善精子形態(tài)，可能是因為破壞RNF8與Miwi蛋白的穩(wěn)定螯合作用而恢復(fù)了組蛋白-魚精蛋白交換功能，提示這一策略或可有效治療少弱精癥、無精癥、畸精癥。

3.調(diào)控mRNA的表達(dá)：有學(xué)者認(rèn)為，Miwi-piRNA與脫腺苷酸酶CAF1形成復(fù)合體后，可通過與靶mRNA不完全互補配對，從而誘發(fā)靶mRNA脫腺苷酸酶而降解[23]。MEAL是一種piRNA通路中的保守的蛋白免疫復(fù)合物，學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在MEAL129無效突變小鼠的睪丸中，piRNA的表達(dá)下降，合并有編碼鞭毛蛋白與翻譯頂體蛋白等有蛋白翻譯及編碼功能的mRNA的下降[26]。Zhang等[27]研究小鼠睪丸中裂解的mRNA碎片，并對比小鼠球形精子期的研究后提出新的觀點，認(rèn)為Mili與piRNA結(jié)合后可通過堿基互補配對識別并結(jié)合靶mRNA，并直接切割與piRNA結(jié)合的mRNA，導(dǎo)致mRNA剪切片段的富集，而在Miwi催化區(qū)域喪失后，mRNA剪切片段富集程度明顯下降。因此，piRNA對mRNA的調(diào)控主要體現(xiàn)在對靶mRNA的降解作用與剪切作用兩方面。

4.基因甲基化修飾：CpG島是指DNA中胞嘧啶C與鳥嘌呤G含量很高的區(qū)域，靠近啟動子，CpG島超甲基化抑制基因的表達(dá)，低甲基化則促進(jìn)基因的表達(dá)。有學(xué)者對比了男性不育患者與正常對照男性的血液樣本中471個CpG島，揭示了Piwil 1與Piwil 2蛋白等位基因特異性的DNA甲基化的差異，說明ENO1、MTA2、BRSK2與LBX2等等位基因不同程度的甲基化參與了piRNA的作用，并干擾生精過程[28]。特別是一項在動物中的研究顯示[29]，ENO1通過編碼的酶活性調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，該蛋白表達(dá)的升高伴隨著公牛生育力升高，因此其蛋白表達(dá)被認(rèn)為是男性生殖能力評估的一種全新標(biāo)志物。

5. 染色質(zhì)重塑：精子形成過程中因體積的急劇變小，導(dǎo)致染色質(zhì)極度濃縮重塑，DNA片段折疊增多。精子細(xì)胞階段，通過組蛋白H4的高度乙?；?，大部分組蛋白被魚精蛋白替換，進(jìn)一步提高DNA的壓縮程度與安全性。而上述組蛋白與魚精蛋白的交換過程需要Miwi蛋白的晚期降解，若Miwi蛋白發(fā)生障礙或功能異常，則導(dǎo)致組蛋白與魚精蛋白交換障礙，導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié)構(gòu)疏松，嚴(yán)重影響染色質(zhì)壓縮的安全性以及基因組DNA的穩(wěn)定性，并影響甚至阻滯染色質(zhì)重塑，導(dǎo)致雄性不育。因此，piRNA通路在染色質(zhì)重塑中異常重要[18]。

三、piRNA的其他作用

1. 腫瘤的發(fā)生發(fā)展：有研究發(fā)現(xiàn)，PIWI和piRNA的表達(dá)水平與腫瘤類型及分期密切相關(guān)。在腫瘤進(jìn)展中，Piwil 1、Piwil 2、Piwil 3和Piwil 4四種蛋白隨著臨床分期的增加，下降趨勢愈發(fā)明顯，這可能提示PIWI蛋白可以擾亂腫瘤細(xì)胞的增值，影響腫瘤細(xì)胞凋亡，其降低則導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，因此檢測PIWI蛋白表達(dá)或具有全新的預(yù)測價值。FOXO4屬于forkhead box基因家族，參與細(xì)胞增殖、凋亡等重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，主要功能有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，GAS5(growth arrest-specific transcript 5)來源的piRNA能上調(diào)FOXO4基因及TRAIL的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，同時通過上調(diào)vimentin來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[30]。Akkouche等[31]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者體內(nèi)piRNA有部分表達(dá)上調(diào)，部分表達(dá)下調(diào)。

2. 卵巢中的作用：有研究發(fā)現(xiàn)，果蠅胚胎中短暫的Piwi蛋白的降低，將導(dǎo)致卵巢piRNA簇中的H3K9me3減少，并導(dǎo)致卵巢piRNA的生物合成受到影響，因此導(dǎo)致轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的累積，最終導(dǎo)致雌性不育；而Piwi在后期發(fā)育階段的減少并不影響到piRNA簇，這可能意味著在胚胎發(fā)育期間，piRNA簇以Piwi依賴的方式進(jìn)行表觀遺傳[32]。

3. 其他：MAEL被發(fā)現(xiàn)在粗線期piRNA的生物合成和維持不可或缺，主要體現(xiàn)在MAEL通過它的HMG-box(high mobility group box)蛋白與piRNA前體結(jié)合并協(xié)助其穿過核孔聚集到nuage[17]，MAEL突變基因的小鼠出現(xiàn)頂體與鞭毛異常[26]。PiRNA-3878的過表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與庫蚊的擬除蟲菊酯抗性有關(guān)，下調(diào)其靶標(biāo)CpCYP307B1的表達(dá)后蚊蟲死亡率上升[33]。有研究發(fā)現(xiàn)[34]，snoRNA衍生和C/D-box保守的piRNA在人原代CD4 T淋巴細(xì)胞中極為豐富，而piRNA(piR30840)可通過完全互補配對與pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合，顯著下調(diào)白細(xì)胞介素-4(IL-4)，并因此抑制Th2淋巴細(xì)胞的發(fā)育，這可能成為過敏治療的新靶標(biāo)。

四、總結(jié)和展望

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)piRNA以多種不同機制參與生精過程的調(diào)控，甚至可能與種族、男性不育類型等有關(guān)。有報道發(fā)現(xiàn)，在印度梗阻性無精癥患者與正常生育人群中rs508485基因多態(tài)性無明顯差異[35]，而中國人群中的研究結(jié)果與此相反，rs508485與rs77559927基因多態(tài)性可誘發(fā)精子發(fā)生缺陷，增加無精癥的風(fēng)險[36-37]。所以，piRNA的研究可能需要考慮到種族差異、表觀遺傳學(xué)、男性不育類型等，以及更大規(guī)模的研究。Hong等[38]發(fā)現(xiàn)，在精漿中piRNA水平從正常男性、少弱精癥，到無精癥患者逐步降低，而且piRNA水平與精子活力正相關(guān)，而且已經(jīng)確定精漿中5種piRNA與不育相關(guān)；李潔等[39]發(fā)現(xiàn)，隨著男性精子核DNA碎片指數(shù)的升高，piRNA-013423與piRNA023386有所下降，說明piRNA可能與精子核DNA的完整性有關(guān)系。雖然具體機制不明，但是這些都說明精漿piRNA可作為男性不育的特異性非侵入性生物標(biāo)志物，為評價男性生育力提供新的途徑與方法。Gou等[18]雖然發(fā)現(xiàn)了控制Piwi蛋白泛素化修飾降解的關(guān)鍵元件D-box，并在小鼠體內(nèi)得以驗證和治療，但是篩查了413例無精癥、弱精癥患者僅有3例為Miwi/D-box雜合突變，說明生精過程極為復(fù)雜，其他通路導(dǎo)致的生精障礙仍值得探討與研究，但是也說明有些類型的男性不育是有可能可以克服或者逆轉(zhuǎn)的。而且既然與男性不育密切相關(guān)，也是否意味著給男性避孕提供了新的思路與方法？

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