劉海濤 姚夢楠 薛慧 閆京山 王俊杰

（北京海光儀器有限公司，北京100016）

前言

砷元素廣泛存在于自然界中，尤其在食品安全和環(huán)境領域，越來越受到社會的廣泛重視，作為重金屬元素之一的砷，已成為食品安全重點檢測的項目。經(jīng)過大量食品中砷的檢測發(fā)現(xiàn)，海產(chǎn)品中砷的含量普遍高于陸地生長物種[1]，有些要高出陸地物種好幾倍，其中典型代表就是海藻類植物，如海帶、紫菜、羊棲菜等本身具有很強的吸附特性，會富集大量的砷。然而，我們常以藻類或其它海產(chǎn)品為食，造成大量中毒現(xiàn)象卻沒有發(fā)生。后來，經(jīng)過大量實驗研究，發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品中存在的砷形態(tài)與陸生物種不盡相同，其大多存在砷形態(tài)為有機砷，例如砷糖、砷甜菜堿、砷膽堿等，其毒性很弱，甚至有報道研究為無毒砷形態(tài)；而毒性很強的無機砷含量比較低。所以我們在分析此類產(chǎn)品砷含量時，要加以區(qū)分有毒和無毒砷形態(tài)，制定出行之有效的檢測方法。

目前國內新修訂現(xiàn)行的食品中無機砷檢測國家標準GB5009.11—2014方法中采用聯(lián)用方法分析測定無機砷[2]。目前GB5009.11—2014中規(guī)定此類產(chǎn)品中無機砷采用液相色譜梯度洗脫，分離有機砷和無機砷，以達到消除有機砷對無機砷測定干擾的目的。樣品提取方法中，砷糖等有機砷以及提取過程中的中間有機砷產(chǎn)物可能和三價砷在色譜分離出峰位置上距離較近，有些難以分開，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尤其藻類等植物體內含有大量砷糖類化合物，會干擾三價無機砷檢測。而動物類產(chǎn)品中含有大量砷膽堿、砷甜菜堿等有機砷物質，此類砷化合物在通常條件下很難發(fā)生氫化物反應，原子熒光不會檢出信號，因此不會對無機砷造成干擾，動物類樣品用等度洗脫分離完全可以滿足無機砷的檢測。本文重點在于對植物樣品無機砷檢測方法進行研究，樣品前處理方法加以改進。

當前標準中，梯度洗脫就是利用較低強度的緩沖液流動相將前期出峰的色譜圖完全分開，不干擾三價無機砷的檢測。然而液相梯度分析過程比較繁瑣，出峰時間長，需要二元高壓泵或其它帶有梯度模式色譜泵才能實現(xiàn)，對操作人員和技術要求均較高，尤其對于廣大從事無機元素分析的人員來說，操作更為困難。本文提出一種新的測定方法，對梯度法進行改進，僅用等度液相泵就可以完成分析過程。本文實驗用最佳的樣品提取酸度和溫度，樣品處理后，為解決三價砷出峰位置和有機砷干擾重合問題，加入一定量的H2O2氧化三價砷到五價砷，這樣測定五價砷的量即為總的無機砷含量。本方法既解決了三價砷和有機砷難以分開問題，又可以使用簡單的等度液相洗脫方法分離砷形態(tài)，使得分析樣品時間大大縮短，較好解決了此類樣品中無機砷的檢測問題。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

LC-AFS9560液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀（北京海光儀器有限公司）；液相色譜自動進樣器（Spark Holland）；超聲波振蕩器；漩渦混合器；高速離心機；恒溫水浴震蕩器；溶劑過濾器。陰離子交換色譜柱（漢密爾頓），陰離子保護柱（漢密爾頓）。

鹽酸（優(yōu)級純）、硝酸（優(yōu)級純）、硼氫化鉀（KBH4）、氫氧化鈉（NaOH）、甲醇（色譜純）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、甲酸、正己烷，三價砷As（Ⅲ）、五價砷As（V），均為標準物質，購于中國計量院，一甲基砷[CH3AsO（ONa）2·6H2O，MMA，標準物質，購于中國計量院]、二甲基砷[（CH3）2AsO2H，DMA，標準物質，購于中國計量院）、氬氣（純度≥99.99%）、0.45μm濾膜。，除另有說明外，所用試劑均為優(yōu)級純，實驗用水應符合國家標準中規(guī)定的一級水。

1.2 樣品處理

1.2.1 水產(chǎn)動物樣品

取水產(chǎn)動物樣品可食部分進行粉碎勻漿，稱取勻漿后樣品1.0 g（或干樣0.2～0.5 g）（精確至0.000 1 g），置于50 m L離心管中，加入20 m L HNO3（0.15 mol/L）作提取劑，在漩渦混合器上充分混勻。于90℃水浴下恒溫震搖浸提2.5 h，每半小時搖勻1次。提取結束，需冷卻到室溫，于離心機5 000 r/min下離心20 min。取10 m L上層清液置于離心管中，加入10 m L正己烷，用力振搖1 min后，除去脂肪及大量有機物，舍棄上層液體。于離心機5 000 r/min下再離心20 min。按此過程重復萃取一次，舍棄上層液體，用滴管吸取下層清液，依次用C18小柱凈化及0.45μm有機濾膜過濾后進樣。

1.2.2 水產(chǎn)植物樣品

稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）海藻類干樣于50 m L離心管中，加人20 mLHCl（1.0%）提取劑，在漩渦混合器上充分混勻，于90℃水浴恒溫震搖浸提2.5 h，提取完畢，需冷卻到室溫，于離心機5 000 r/min下離心20 min。滴管吸取上層清液用0.45μm有機濾膜過濾，取0.5 mL濾液，加入0.2 m L過氧化氫（H2O2），用水稀釋定容至2.0 m L，搖勻后于70℃水浴下恒溫氧化20 min，將三價砷氧化為五價砷，取出冷卻至室溫，上機測定，最終通過對五價砷的測定得到樣品中總無機砷含量。對于無機砷含量較低的水產(chǎn)植物類樣品，可直接吸取1.8 m L上清液加人0.2 m L雙氧水，直接氧化，搖勻后，于70℃水浴下恒溫氧化20 min，取出冷卻至室溫，上機測量。過氧化氫加入量為確定定容體積的10%。樣品和提取液中總砷的分析測定，參考《食品中總砷及無機砷的測定》（GB/T5009.11—2014）[2]。

1.3 儀器工作條件選擇

實驗中具體條件見表1。

表1 無機砷測定的LC-AFS條件Table 1 LC-AFS of inorganic arsenic detection conditions

1.4 標準溶液制備

砷的混合標準儲備溶液需要相應的MMA、DMA、Asバ和As（V）標準物質稀釋得到，砷的混合標準工作溶液，由于溶液穩(wěn)定性易受環(huán)境影響，容易轉化，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，本實驗配制成10、20、40、80、100μg/L的濃度曲線。在優(yōu)化好的儀器實驗條件下，計算擬合標準曲線，混合標準分離色譜圖見圖1，線性方程見表2。

2 結果與討論

2.1 流動相選擇

圖1 不同濃度砷形態(tài)分離譜圖Figure 1 Chromatogram of arsenic in different concentrations.

分別對磷酸二氫鈉、流動相磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液作為流動相進行選擇實驗，選取最佳分離條件[6-7]。以磷酸二氫鈉（10 mmol/L）溶液為流動相，p H值為9.0進行分離測定時，分離效果較好，但DMA和Asバ信號強度低，分析時間較長；以磷酸二氫銨（15 mmol/L）溶液為流動相，調節(jié)p H值為6.0進行分離測定時，砷各形態(tài)出峰時間均較長，DMA和As（V）信號強度較低，分離效果較好，見圖2；以磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液為流動相，p H值為5.92進行分離實驗時，砷4種形態(tài)在6 min內完全分離，峰形尖銳，且信號強度高，見圖3，因此實驗選擇磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合液作為流動相。

表2 砷形態(tài)曲線回歸方程Table 2 Regression equation of arsenic speciation curve

2.2 提取劑及濃度選擇

提取劑是保證樣品中砷形態(tài)提取效率的前提，也是制約本實驗方法準確度的關鍵。目前，海產(chǎn)品中砷形態(tài)常用的提取劑主要有水、酸、和堿[7]，經(jīng)過實驗比較，稀酸為良好的砷提取劑，通常首選鹽酸體系。選擇無機砷含量較高的樣品羊棲菜為研究對象，稱取1.0 g干樣（精確至0.000 1 g，粉碎均勻后使用），采用不同濃度酸進行提取實驗，比較研究了在0.5%～50%鹽酸溶液范圍內，90℃水浴下恒溫震搖2.5 h后測定?？紤]到羊棲菜中無機砷含量可能偏高以及色譜柱的耐酸程度，提取完畢后，將實驗中各鹽酸濃度浸提液稀釋10倍后上機測定，無機砷含量結果見表3。

重點研究不同濃度鹽酸溶液對無機砷提取率的影響，由圖4可知，提取劑鹽酸濃度在0.5%～50%范圍，測得無機砷含量變化在29.68～31.25 mg/kg，當鹽酸濃度在1.0%～40%范圍變化時，相對于其它濃度提取的無機砷效率較高，通過提取率實驗可知，較低濃度鹽酸已完全將羊棲菜等藻類植物中的無機砷提取?？紤]到陰離子交換色譜柱耐酸性較差，沒有對大于50%的高濃度鹽酸實驗。同時為減小稀釋倍數(shù)過大帶來的測量誤差，有利于低濃度樣品的檢出，因此提取劑的濃度選用濃度較低的鹽酸（1.0%）溶液，測定結果見表3。

2.3 氧化劑加入對中間產(chǎn)物影響

氧化劑的使用可以完全將三價砷氧化成五價砷，但是，氧化劑會不會對樣品中的有機砷產(chǎn)生影響呢，也許會存在有機砷向無機砷轉化的過程，也會造成對五價砷測定的干擾。帶著這樣的疑問，本實驗重點研究氧化劑對于有機砷的干擾問題。許多實驗研究發(fā)現(xiàn)，使用酸浸提會使樣品中大分子有機砷，如砷糖，砷脂類等分解轉化為小分子有機砷，DMA、MMA等。為了驗證用鹽酸（1.0%）提取劑提取樣品，大分子有機砷及中間產(chǎn)物是否受氧化劑影響，分別進行了加標回收和對比實驗。在樣品中加入DMA和MMA標準溶液，按樣品處理方法進行酸提取及H2O2氧化的全過程，然后上機測定，結果DMA和MMA的加標回收率均在90%～105.0%，五價砷的含量沒有增加，說明樣品中的有機砷或中間產(chǎn)物DMA和MMA在酸提取及H2O2氧化過程中不會轉化為無機砷，不會對無機砷的測定造成干擾。加入氧化劑H2O2只會氧化三價砷到五價砷，圖5（a）為空白樣品中加入無機砷和DMA、MMA標準溶液譜圖，圖5（b）為經(jīng)過氧化后測試譜圖，有機砷DMA和MMA無變化，三價砷被氧化為五價砷。

表3 羊棲菜樣品在不同鹽酸濃度下砷的提取率和無機砷含量Table 3 The extraction rate of Sargassum samples in different concentration of hydrochloric acid and arsenic and inorganic arsenic /(mg·kg-1)

圖4 不同提取酸度下無機砷測定值Figure 4 Determination of different extraction acidity of inorganic arsenic.

2.4 氧化劑加入量的影響

既然選擇加入過氧化氫來氧化三價無機砷到五價砷[8]，可以解決海產(chǎn)品有機砷對于三價砷干擾問題，本實驗繼續(xù)對氧化劑加入量以及氧化時間進行探索，在樣品提取液中分別加入5%、10%、20%、30%、40%、50%不同比例過氧化氫，按同一條件70℃恒溫水浴20 min，冷卻后測定，結果表明，10%～50%的氧化劑氧化后，測得的總無機砷量無變化（見表4），說明10%氧化劑量足以將三價無機砷完全氧化到五價砷，所以實驗選擇氧化劑為過氧化氫（10%）。同時還對水浴溫度對氧化效率進行了實驗，實驗不同溫度50～90℃下影響，結果表明，溫度越低，完全氧化需要時間較長，提高溫度有助于快速氧化，但考慮到溫度過高，過氧化氫會分解，且過氧化氫氧化能力很強，最快15 min就能氧化完全，綜合考慮，實驗最終選擇10%氧化劑量，水浴溫度70℃，氧化時間20 min較好。羊棲菜樣品氧化后見圖6、圖7。

圖5 有機砷氧化過程轉化實驗對比Figure 5 Comparison of conversion experiments of organic arsenic oxidation process.

圖6 羊棲菜氧化實驗圖Figure 6 The chart of oxidation experiment of sargassum.

2.5 方法準確度及精密度實驗

實驗分別以動物性海產(chǎn)品和藻類產(chǎn)品為測定對象，藻類樣品提取液測試前加入過氧化氫氧化后測定，進行精密度實驗和加標回收實驗。分析樣品采用超市和市場上常見的海產(chǎn)品進行分析，國家食品污染物限量[3]標準對于海產(chǎn)品中無機砷限量要求小于0.5 mg/kg，采集樣本后，處理前分別添加0.5 mg/kg和1.0 mg/kg無機砷標準物質進行實驗，實驗結果見表4。實際樣品分析平均加標回收率都在85%～105%，每個樣品平行三個，相對標準偏差RSD小于5%。實驗結果表明，聯(lián)用分析方法可以滿足無機砷檢測需求。分析結果見圖8。

圖7 不同過氧化氫含量下無機砷測定值Figure 7 Determination of hydrogen peroxide content under different inorganic arsenic.

圖8 實際樣品及加標譜圖Figure 8 The spectrum of actual sample and standard.

表4 樣品測試結果Table 4 Sample test results /(mg·kg-1)

3 結論

采用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用分析方法對原有無機砷檢測方法進行改進研究，證明了原有海產(chǎn)品無機砷檢測方法的主要問題在于需要運用梯度洗脫方式才能有效分離樣品中的有機和無機砷形態(tài)，過程比較繁瑣，分析周期較長，且對于儀器操作者和儀器設備均提出較高要求。本文對當前方法進行改進，尤其對藻類等植物樣品處理上，通過加入氧化劑氧化三價砷方式和干擾有機砷分離，而且實驗過程中也證明了有機砷不會向無機砷轉化，不會對無機砷測定產(chǎn)生干擾。本實驗方法的改進證明可以應用于海產(chǎn)品中無機砷的檢測。

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[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.11—2014食品中總砷及無機砷的測定[S].北京：中國標準出版社，2014.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2762—2012食品中污染物限量[S].北京：中國標準出版社，2012.

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