李龍囡，丁晴，孫鵬飛

(1.無錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 無錫 214028；2.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214000)

·基礎(chǔ)研究·

不同產(chǎn)地鐵皮石斛的質(zhì)量比較研究

李龍囡1*，丁晴1，孫鵬飛2

(1.無錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 無錫 214028；2.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214000)

目的比較云南、福建、江蘇、浙江產(chǎn)鐵皮石斛在浸出物、多糖、甘露糖、氨基酸以及微量元素上的差異，以期為鐵皮石斛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。方法參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，采用熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物的含量；采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，HPLC法測(cè)定甘露糖含量；通過酸水解法提取，采用氨基酸分析儀測(cè)定18種氨基酸的含量；采用微波消解ICP-MS法測(cè)定鐵皮石斛中微量元素的含量。結(jié)果不同產(chǎn)地的鐵皮石斛浸出物含量以浙江、福建兩省的含量較高；多糖、甘露糖含量分別在22.5%～63.5%和14.1%～49.2%，其中以浙江產(chǎn)含量較高；鐵皮石斛中總氨基酸平均含量在24.05 mg·g-1，其中人體必需氨基酸占總氨基酸含量的36%，不同產(chǎn)地的氨基酸含量存在較大差異，以福建漳浦產(chǎn)含量較高；鐵皮石斛中含有豐富的人體必需元素，不同產(chǎn)地之間以浙江產(chǎn)含量較高。結(jié)論不同產(chǎn)地鐵皮石斛的主要活性成分存在較大的差異，其品質(zhì)高低受環(huán)境的影響，綜合來看以浙江產(chǎn)品質(zhì)為優(yōu)，其次為福建漳浦。

鐵皮石斛；不同產(chǎn)地；浸出物；多糖；甘露糖；氨基酸；微量元素

鐵皮石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，自古以來就有“藥中黃金”之美譽(yù)，為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功能。目前，研究表明鐵皮石斛中含有多糖、生物堿、氨基酸[1]、微量元素[2-3]等多種成分，其中多糖為其主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其在抗衰老、降血糖、抗腫瘤等方面有很好功效[4-6]。

近年來，鐵皮石斛藥材、飲片以及以鐵皮石斛為原料的保健品越來越受歡迎，但由于過度采挖，野生的鐵皮石斛已非常稀少，目前市售的鐵皮石斛基本為人工栽培。其中主要產(chǎn)區(qū)在浙江、云南、安徽、福建等地，目前江蘇、廣東也在大力發(fā)展鐵皮石斛人工種植，對(duì)緩解野生鐵皮石斛稀缺有重要的作用。但由于不同地區(qū)氣候環(huán)境、種植經(jīng)驗(yàn)等的不同，對(duì)藥材活性成分和藥性都會(huì)有一定的影響，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛其在多糖、生物堿、菲類及聯(lián)芐類成分等藥性物質(zhì)含量上存在顯著差異[7-8]。為了考察不同地區(qū)人工栽培鐵皮石斛的品質(zhì)，本文選取6個(gè)產(chǎn)地12批樣品，對(duì)其主要活性成分進(jìn)行測(cè)定和比較，分析其在浸出物、多糖、甘露糖、氨基酸及微量元素方面的差異，以期為鐵皮石斛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、資源評(píng)價(jià)以及進(jìn)一步的資源開發(fā)利用提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DMS100型烘箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；XS205型電子天平(梅特勒-托利多公司)；Sorvall ST16型離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；HHS-4S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司)；U3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；SYKAM S-433D氨基酸自動(dòng)分析儀(鈉離子系統(tǒng)，北京捷盛依科科技有限公司)；MARS高通量密閉微波消解儀(CEM公司)；ICP-MS(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Milli-Q純水機(jī)(密理博公司)。

1.2 材料

對(duì)照品無水葡萄糖(批號(hào)：110833-201506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、鹽酸氨基葡萄糖(批號(hào)：140649-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)、甘露糖(批號(hào)：140651-201504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%)、18種氨基酸對(duì)照品(批號(hào)：140624-200805)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；22種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1)，Ba、Bi、Ce、Co、In、li、U 調(diào)諧液(均1.0 μg·L-1)，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。乙腈為色譜純[霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司]；硝酸為優(yōu)級(jí)純(默克公司)；其余試劑均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

本次實(shí)驗(yàn)收集了來自云南瑞麗、福建漳浦、江蘇無錫、江蘇宜興、浙江樂清、浙江雁蕩山4個(gè)省6個(gè)地區(qū)不同規(guī)格共計(jì)12批次的鐵皮石斛樣品，均為3年生樣品，采收時(shí)間為清明前后，經(jīng)無錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心主任中藥師丁晴鑒定為鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo，樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品信息

注：鐵皮石斛鮮條在60 ℃烘干后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物含量測(cè)定

參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)(四部)通則2201浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，以乙醇為溶劑，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛浸出物含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

醇溶性浸出物一般表征鐵皮石斛中生物堿的含量，也是評(píng)價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，浸出物含量偏低是導(dǎo)致鐵皮石斛不合格較為常見的原因。被測(cè)12批樣品中有3批低于《中國(guó)藥典》規(guī)定的6.5%，分別為無錫產(chǎn)兩批和宜興產(chǎn)1批，不同產(chǎn)地之間浸出物含量也有所差異，其中福建漳浦1號(hào)樣品浸出物含量最高，其次為浙江樂清2號(hào)樣品。

2.2 多糖含量測(cè)定

參照2015年版《中國(guó)藥典》(一部)鐵皮石斛項(xiàng)下的多糖含量，采用苯酚-硫酸法測(cè)定，結(jié)果見表3。

2.3 甘露糖含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18MG II(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液(22∶78)；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算大于4000，供試品色譜中甘露糖與相鄰組分分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；1.甘露糖；2.鹽酸氨基葡萄糖；3.葡萄糖；4.PMP。圖1 對(duì)照品及供試品溶液HPLC圖

2.3.2 測(cè)定方法 參照2015年版《中國(guó)藥典》(一部)鐵皮石斛項(xiàng)下的甘露糖含量測(cè)定方法，以鹽酸氨基葡萄糖為內(nèi)標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛多糖、甘露糖含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

從表3看出，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛在多糖、甘露糖含量上均存在差異。多糖含量在22.50%～63.49%，除云南瑞麗2號(hào)樣品外，其余均符合《中國(guó)藥典》2015年版(一部)中規(guī)定的25.0%，其中以浙江、江蘇宜興的樣品含量較高。甘露糖含量在14.10%～49.20%，其中宜興地區(qū)兩批樣品的含量較高，均超過《中國(guó)藥典》規(guī)定的上限38.0%，而含量最低的為云南瑞麗2號(hào)樣品，這一結(jié)果和多糖含量的檢測(cè)結(jié)果一致。其中有3批樣品的甘露糖與葡萄糖峰面積比不符合《中國(guó)藥典》規(guī)定，分別為無錫產(chǎn)2批和云南瑞麗產(chǎn)1批，比值均偏低。綜上，從多糖、甘露糖兩個(gè)指標(biāo)來看，以浙江地區(qū)的鐵皮石斛品質(zhì)較好。

2.4 氨基酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 采用Na+型磺酸基強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂色譜柱(150 mm×4.6 mm，7 μm)；柱溫：58 ℃；流動(dòng)相為不同pH值的檸檬酸鈉緩沖液(流動(dòng)相A的pH為3.52，流動(dòng)相B的pH為10.85)，流動(dòng)相D為2%氫氧化鈉再生液，梯度洗脫，洗脫程序見表4；流動(dòng)相流速：0.45 mL·min-1；2%茚三酮溶液為衍生液，流速：0.25 mL·min-1；反應(yīng)線圈溫度：130 ℃；570、440 nm雙通道紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣量：50 μL。

表4 鐵皮石斛中氨基酸含量測(cè)定的梯度洗脫程序

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取18種氨基酸對(duì)照品適量，用0.02 mol·L-1鹽酸溶液制備對(duì)照品混合溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取鐵皮石斛粉末(過三號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置于水解管中，加入6 mol·L鹽酸溶液10 mL，苯酚3～4滴，充入氮?dú)夥夤?，?10 ℃水解22 h，取出冷卻，過濾至50 mL容量瓶中，用水洗滌水解管及濾紙，合并濾液并加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5 mL于蒸發(fā)皿中，40～50 ℃真空減壓干燥，用0.02 mol·L-1鹽酸溶液溶解并定容至2 mL，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各50 μL，注入氨基酸分析儀測(cè)定。

不同產(chǎn)地鐵皮石斛中18種氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見表5，可以看出鐵皮石斛含有豐富的人體必需氨基酸，平均含量為8.76 mg·g-1，約占總氨基酸含量的36%。其中以亮氨酸含量最高，占必需氨基酸總量的26.4%，這與張愛蓮等人的研究結(jié)果相一致[9]。鐵皮石斛總氨基酸平均含量為24.05 mg·g-1，以門冬氨酸和谷氨酸為主要氨基酸，分別占總氨基酸的14.0%和12.8%，鐵皮石斛之所以甘淡、微咸，與其氨基酸組成性質(zhì)是息息相關(guān)的[10]。分析不同產(chǎn)地鐵皮石斛的氨基酸含量，結(jié)果表明不同產(chǎn)地之間存在較大差異，其中以福建漳浦1號(hào)的含量為最高，總量達(dá)41.96 mg·g-1，必需氨基酸的量達(dá)15.48 mg·g-1，4個(gè)不同省份樣品總氨基酸平均含量由高到低依次為福建省、浙江省、云南省、江蘇省，必需氨基酸結(jié)果與其一致，說明不同地理環(huán)境對(duì)鐵皮石斛氨基酸的積累有一定影響。另外，從結(jié)果中可以看出，浙江省3批樣品中，仿野生栽培樣品的氨基酸含量要高于大棚種植的樣品。

表5 不同產(chǎn)地鐵皮石斛氨基酸含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

注：*為人體必需氨基酸。

2.5 元素含量測(cè)定

2.5.1 ICP-MS分析測(cè)定條件 采用KED分析模式，霧化室溫度：2 ℃，載氣流速：1.0 L·min-1，輔助氣流速：0.8 L·min-1，冷卻氣流速：13.0 L·min-1，載氣為高純氬，碰撞氣體為高純氦，氦氣流速：4.3 mL·min-1；射頻功率：1.55 kW，采樣深度：5 mm，讀數(shù)3次。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密量取25種元素(9Be、23Na、24Mg、27Al、39K、48Ti、51V、52Cr、55Mn、40Ca、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、88Sr、95Mo、107Ag、111Cd、118Sn、137Ba、202Hg、205Tl、208Pb)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1)適量，用10%HNO3稀釋制成濃度為0、25、50、100、200、500、1000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取鐵皮石斛粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，置消化管中，精密稱定，加硝酸5 mL，于加熱板上進(jìn)行預(yù)消解(120 ℃，30 min)，冷卻，移至微波消解儀中進(jìn)行微波消解(功率1000 W；溫度180 ℃，25 min)，消解完全后，冷卻至60℃以下，取出消解管，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水沖洗消解管以及蓋子上的殘留溶液，合并沖洗液，加入200 μL的金標(biāo)溶液(1 μg·mL-1)，加水定容至刻度，搖勻，離心(3000 r·min-1，5 min)，取上清液作為供試品溶液。除不加金標(biāo)外，同法制備試劑空白溶液。

25種元素中，除9Be、95Mo、107Ag、118Sn、202Hg5種元素未檢出外，其余均檢出，5種重金屬及有害元素、8種主要的人體必需元素測(cè)定結(jié)果見表6、表7，其余含量較少的元素未列出。

表6 不同產(chǎn)地鐵皮石斛重金屬及有害元素測(cè)定結(jié)果(n=2)

注：—表示未檢出。

鉛、鎘、砷、汞、銅這5種重金屬及有害元素在人體內(nèi)蓄積至一定量時(shí)可引起免疫系統(tǒng)障礙和多種功能損害。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限度，如《中國(guó)藥典》2015年版(一部)植物藥(白芍等)標(biāo)準(zhǔn)限度規(guī)定：鉛不得過5 mg·kg-1，鎘不得過0.3 mg·kg-1，砷不得過2 mg·kg-1，汞不得過0.2 mg·kg-1，銅不得過20 mg·kg-1。表6顯示，12批鐵皮石斛中5種重金屬及有害元素的測(cè)定結(jié)果均在合格范圍內(nèi)。

表7 不同產(chǎn)地鐵皮石斛微量元素測(cè)定結(jié)果(n=2)

從表7中可以看出，鐵皮石斛含有豐富的人體必需元素，其中鉀、鈣、鎂平均含量分別為7 433.43、1 817.20、1 664.22 mg·kg-1；鋅、鐵、錳、鉻、鍶平均含量分別為23.08、47.71、69.10、1.00、46.59 mg·kg-1。其中錳和鍶都是人體必不可少的微量元素，與骨骼的形成密切相關(guān)；鉻雖然在人體中的需要量很少，正常人體內(nèi)只含6～7 mg，但也很重要，其主要在糖代謝中起作用。不同產(chǎn)地之間的鐵皮石斛在微量元素含量上存在較大差異，綜合來看，以浙江地區(qū)種植的鐵皮石斛微量元素含量較高，尤其是鉀、鈣、鎂、錳4種元素，顯著高于其他地區(qū)；其次為福建漳浦樣品，其中漳浦1號(hào)樣品的鐵元素含量在所有地區(qū)中為最高。

3 討論

鐵皮石斛作為名貴中草藥，具有多種生物學(xué)活性，本文通過對(duì)4個(gè)省6個(gè)產(chǎn)地12批樣品的浸出物、多糖、甘露糖、氨基酸及微量元素進(jìn)行分析，結(jié)果表明鐵皮石斛含有大量的多糖以及人體必需的氨基酸及微量元素，這些成分可能協(xié)同發(fā)揮鐵皮石斛抗氧化、抗衰老、促進(jìn)免疫力等功效。供試的12批樣品中，有3批浸出物含量低于《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，浸出物含量偏低是導(dǎo)致鐵皮石斛不合格較為常見的原因；僅1批多糖含量低于《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，各個(gè)產(chǎn)地整體品質(zhì)良好，其中2批甘露糖含量超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其甘露糖和葡糖峰面積比也較高，不同品種鐵皮石斛多糖中甘露糖所占比例可能不同[11]，這一指標(biāo)還有待研究；在重金屬及有害元素方面，12批樣品均未超出相關(guān)限度規(guī)定，說明鐵皮石斛在重金屬限量上整體是安全的。氨基酸及微量元素的含量與浸出物、多糖等的含量基本一致，多糖含量高的樣品其氨基酸、微量元素的含量也較高。

通過對(duì)比6個(gè)不同地區(qū)鐵皮石斛的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果表明其品質(zhì)高低受環(huán)境影響，不同產(chǎn)地之間存在較大的差異。綜合來看，以浙江、福建兩省的品質(zhì)為優(yōu)，其中以浙江產(chǎn)的鐵皮石斛品質(zhì)為最佳，浙江作為我國(guó)規(guī)模最大的鐵皮石斛生產(chǎn)區(qū)，擁有豐富的種植經(jīng)驗(yàn)，其種植資源和管理資源均好于其他地區(qū)，完善成熟的生產(chǎn)管理體系是這一地區(qū)鐵皮石斛品質(zhì)較優(yōu)的原因之一；其次，浙江樂清、雁蕩山較其他地方溫度低，四季溫差較為明顯，海拔也較高，這有利于鐵皮石斛有效成分的富集，表現(xiàn)出較其他地區(qū)好的品質(zhì)；浙江樂清兩批樣品，采用仿野生栽培方式，也較大棚種植有利于其活性成分的積累。鐵皮石斛為多年生附生草本，生境獨(dú)特，對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，本文初步對(duì)比了幾大產(chǎn)地鐵皮石斛的浸出物、多糖、甘露糖、氨基酸及微量元素的差異，為鐵皮石斛的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了一定的參考，但影響其活性成分累積的各種因素仍值得進(jìn)一步深入研究，可為人工栽培鐵皮石斛的品質(zhì)保證提供科學(xué)指導(dǎo)。

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StudyonQualityofDendrobiumofficinaleinDifferentRegions

LILongnan1*，DINGQing1，SUNPengfei2

(1.WuxiInstituteforDrugControl，Wuxi214028，China；2.JiangnanUniversity，Wuxi214000，China)

Objective：In order to provide the quality standard and the exploitation ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo on theoretical basis，samples ofD.officinalefrom different regions were compared in the content of extract，polysaccharides，mannose，amino acids and trace elements.MethodsAccording to 2015 version of “Chinese Pharmacopoeia”，the extract contents were detected with ethanol solvent by hot soak，the polysaccharide contents were determined by phenol-sulfuric acid method and the concentration of mannose was determined by HPLC.The amino acid contents were determined by amino acid analyzer through acid hydrolyzed.Trace elements ofD.officinalewere detected by microwave digestion and ICP-MS technique.ResultsThe extract content was higher in samples from Zhejiang and Fujian province than that in samples from other regions.The polysaccharide and mannose content ranged from 22.5% to 63.5% and 14.1% to 49.2%，respectively.The results showed that the concentration were higher in samples from Zhejiang province.The average amino acids concentration was 24.05 mg·g-1，and the essential amino acid accounted for 36% of the total contents of amino acids.There were different contents among different regions，and the sample from Zhangpu of Fujian province was the highest.The experiment showed thatD.officinalecontained many kind of essential trace elements for human body，and the results showed that the concentration were higher in samples from Zhejiang province.ConclusionThere are significant differences among different regions in main active ingredient contents ofD.officinale，and the environment might have effect on the quality.In summary，the quality ofD.officinalefrom Zhejiang province is the best，followed by that from Zhangpu.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo；different regions；extract；polysaccharides；mannose；amino acids；trace elements

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.009

*

李龍囡，工程師，研究方向：中藥檢驗(yàn)；Tel：(0512)66112738，E-mail：laurel0512@126.com

2017-03-24)