吳斌+姜珊珊+張眉+辛志梅+徐德坤+王升吉+辛相啟

摘要：2016年于山東省臨沂市、棗莊市、濟(jì)寧市采集3組小麥黃花葉病毒病發(fā)生嚴(yán)重度不同地塊的土壤，采用平板稀釋分離法分別分離其中的真菌、細(xì)菌和放線菌，統(tǒng)計(jì)土壤微生物總量及3種可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量，研究其與小麥病毒病發(fā)生程度的關(guān)系。結(jié)果表明，同一地塊中細(xì)菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，其次為放線菌，真菌最少；但是分離得到的可培養(yǎng)真菌的種類和數(shù)量最多，其次為細(xì)菌，放線菌數(shù)量最少；并且發(fā)病嚴(yán)重地塊的土壤微生物總量均高于輕病地塊，其中發(fā)病嚴(yán)重地塊的真菌數(shù)量和種類增加的最為顯著，其次為細(xì)菌，放線菌基本無變化。

關(guān)鍵詞：小麥黃花葉病毒病；土壤微生物；真菌；細(xì)菌；放線菌；多樣性

中圖分類號：S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0044-06

Abstract Three groups of wheat soil on that different degree of wheat yellow mosaic virus occurred were collected from Linyi，Zaozhuang and Jining in 2016. The fungi， bacteria， actinomycetes were isolated by plate dilution separation method.The total number of soil microorganisms， and the types and numbers of three cultured microbes were counted， which were used to study their relationships with the occurrence degree of wheat yellow mosaic virus. The results indicated that bacteria assumed absolute superiority in number， followed by actinomycetes， and fungi was the least in the same places.But the type and number of cultured fungi were the largest， followed by bacteria， and those of actinomycetes were the least. The total number of soil microorganisms of serious disease soil was higher than that of light disease soil； the kinds and number of fungi in the serious disease soil had the most significant increasing， followed by bacteria， and actinomycetes had almost no change.

Keywords Wheat yellow mosaic virus；Total number of soil microorganisms；Fungi；Bacteria； Actinomycetes；Diversity

病毒病是小麥生產(chǎn)上一類重要的病害，近年來有逐漸加重的趨勢。我國發(fā)現(xiàn)的小麥病毒病有10多種，其病原主要是小麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV）、小麥叢矮病毒（Wheat rosette virus，WRSV）、小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）和中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）等[1]。小麥黃花葉病毒病是由禾谷多黏菌以持久性方式傳播小麥黃花葉病毒引起的病害，近年來，該病害已成為山東冬小麥種植中的重要病害，在魯西南地區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重。2009年該病在山東臨沂、棗莊等地突發(fā)，2013年的發(fā)病面積約6 670 hm2，2014年僅臨沂市發(fā)病面積就多達(dá) 4 000 hm2，棗莊市發(fā)病面積3 333 hm2左右[2，3]。

研究表明，微生物可以直接參與土壤有機(jī)質(zhì)的形成與養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，其數(shù)量和種類影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，是評價(jià)土壤肥力與健康的生物學(xué)指標(biāo)[4，5]。于慧瑛等[6，7，10]對根腐病人參、枯萎病黃瓜和莖基腐病玉米植株根際土壤中的真菌種類及數(shù)量進(jìn)行分析表明，發(fā)病植株根際土壤中的真菌和病原菌數(shù)量均有所增加，說明土傳病害的發(fā)生與土壤微生態(tài)環(huán)境惡化、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡有緊密的聯(lián)系。過去50年的大量研究表明，多種土傳病毒是由土壤中的真菌或線蟲傳播。但是有關(guān)病毒病根際土壤微生物分布及其變化狀況未見報(bào)道，本研究以小麥黃花葉病毒病發(fā)生度不同地塊的根際土壤為研究對象，測定了土壤微生物的數(shù)量，并對三大微生物分別進(jìn)行了分離、鑒定，以期了解發(fā)生小麥黃花葉病毒病的土壤微生物變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究及科學(xué)合理地利用微生物調(diào)控措施防治小麥黃花葉病毒病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年3月分別于臨沂市板泉鎮(zhèn)葛家宅子村、棗莊市滕州市姜屯鎮(zhèn)奚莊村、濟(jì)寧市曲阜市小雪鎮(zhèn)姜家村3地取樣，每地根據(jù)小麥黃花葉病毒病發(fā)生嚴(yán)重程度選取輕病田與重病田2個(gè)取樣地塊，每個(gè)地塊以5點(diǎn)取樣法采集耕作層0～10 cm的土壤，每點(diǎn)選取5株植株的根際土壤各100 g，混勻，除去雜質(zhì)等，立即進(jìn)行試驗(yàn)。采樣地塊小麥品種均為感病品種臨麥4號。

主要試劑：Easy Taq（5 U/μL）、10×Easy Taq Buffer、dNTPs （含Mg2+，2.5 mmol/L）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他常規(guī)化學(xué)藥品為分析純試劑。試驗(yàn)所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。endprint

1.2 試驗(yàn)儀器

Mastercycler nexus PCR儀、Centrifuge 5430R 小型高速冷凍式離心機(jī)，德國 Eppendorf 公司；JY300基礎(chǔ)型電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)，美國 UVP 公司；ZF-90紫外透射反射分析儀，上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司；AE224C電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物的分離培養(yǎng)與計(jì)數(shù)方法 采用稀釋平板法分離小麥根際土壤菌系。稱取土壤樣品1 g置于100 mL帶有玻璃珠的滅菌水中，振蕩均勻后稀釋為不同濃度，在真菌培養(yǎng)基上稀釋梯度為10-3、10-4、10-5，在放線菌培養(yǎng)基上稀釋梯度為10-4、10-5、10-6，在細(xì)菌培養(yǎng)基上稀釋梯度為10-5、10-6、10-7，在無菌環(huán)境下各吸取100 μL不同濃度的稀釋溶液分別滴于真菌、細(xì)菌及放線菌選擇性培養(yǎng)基平板上。真菌選用馬丁氏培養(yǎng)基，制作平板前每100 mL培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素0.3 mL；細(xì)菌選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌選用改良高氏1號培養(yǎng)基，使用前每100 mL培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀0.3 mL[7]。每個(gè)處理濃度重復(fù)3次，涂布均勻，晾干后真菌和放線菌平板于28℃、細(xì)菌平板于37℃黑暗倒置培養(yǎng)。

真菌培養(yǎng)2～7 d，細(xì)菌培養(yǎng)1～3 d，放線菌培養(yǎng)7～14 d，連續(xù)觀察記錄每皿各種菌的菌落數(shù)，直至同類微生物的菌落數(shù)不再增加為止。結(jié)果以每克干土所含數(shù)量表示。

同時(shí)待菌落長出后，分別挑取單菌落轉(zhuǎn)接、純化培養(yǎng)備用，并統(tǒng)計(jì)各微生物的優(yōu)勢菌屬（平均出現(xiàn)頻率>20%）[7]。

1.3.2 三種微生物基因組DNA的提取 真菌DNA的提?。核蟹蛛x獲得的真菌菌株經(jīng)純化培養(yǎng)，收集菌絲至2 mL的Eppendorf管中，用液氮迅速冷凍并研磨成粉末，采用HP Fungal DNA Kit（美國Omega公司）提取基因組DNA。

細(xì)菌DNA的提取[8]：分離得到的細(xì)菌菌株經(jīng)單菌落純化3次，挑取單菌落置于1 mL的LB培養(yǎng)液中，置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)4～24 h（220 r/min）；12 000 r/min離心5 min，棄上清，管底留約100 μL上清液與菌落沉淀混勻，置于沸水中煮3～5 min；小心吸取上清至1.5 mL Eppendorf管中。

放線菌DNA的提取[9]：取新鮮菌體于2 mL Eppendorf管中，液氮研磨至細(xì)粉狀，加550 μL TE Buffer和20% SDS溶液（65℃預(yù)熱）30 μL，漩渦振蕩5 s，加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕輕混勻后37℃保溫1 h；加等體積酚+氯仿+異戊醇（25∶24∶1）抽提，輕微顛倒混勻，10 000 r/min離心10 min；小心吸取上清至1.5 mL Eppendorf管中，加等體積氯仿+異戊醇（24∶1）抽提，10 000 r/min離心5 min，吸取上清與等體積異丙醇（4℃預(yù)冷）混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清；沉淀用1 mL 70%乙醇（4℃預(yù)冷）洗滌1 min，自然風(fēng)干后加入40 μL ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 菌株的鑒定 利用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′）和ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′），以及16S rRNA通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）分別對3種微生物菌株進(jìn)行擴(kuò)增。ITS1/ITS4引物擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，循環(huán)35次，72℃10 min；27F/1492R引物擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃ 4 min， 94℃ 30 s， 53℃ 30 s， 72℃ 2 min，循環(huán)35次，72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）對目的條帶進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物交由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序，獲得序列在NCBI中進(jìn)行Blast檢索。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理與處理采用Microsoft Excel 2007完成，統(tǒng)計(jì)分析采用DPS（ver. 7.5）進(jìn)行，并采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物的種類與數(shù)量

取樣地塊及其小麥黃花葉病毒病的發(fā)病情況見表1。

采用稀釋平板涂抹培養(yǎng)計(jì)數(shù)法分析[10]土壤微生物數(shù)量，結(jié)果（表2）顯示，每個(gè)取樣點(diǎn)的土壤微生物數(shù)量均呈現(xiàn)細(xì)菌>放線菌>真菌的規(guī)律，并且每個(gè)取樣地的重病田微生物總量均大于輕病田的。除棗莊外，其余兩市重病田的真菌總數(shù)量均顯著增加；三地重病田較輕病田細(xì)菌、放線菌數(shù)量均增加不顯著。

2.2 土壤微生物多樣性

對分離到的菌株進(jìn)行擴(kuò)增分析和鑒定，結(jié)果顯示，引物ITS1/ITS4擴(kuò)增條帶大約為600 bp，27F/1492R引物擴(kuò)增條帶大約為1 400 bp，經(jīng)測序、Blast檢索比對，真菌鑒定結(jié)果見表3，細(xì)菌鑒定結(jié)果見表4，放線菌鑒定結(jié)果見表5。

試驗(yàn)共分離得到49株真菌菌株，臨沂市輕病田共分離到半知菌類和子囊菌門兩大類共5株真菌菌株，其中半知菌類包括3個(gè)屬，分別為鏈格孢屬2株，枝孢屬和金孢霉屬各1株；子囊菌門Paraphaeosphaeria屬的1株真菌。臨沂重病田共分離到半知菌類、子囊菌門、接合菌門三類真菌，半知菌類包括枝孢屬、漆斑霉屬、鏈格孢屬、帚枝霉屬及微座孢屬5個(gè)屬；子囊菌門包括球腔菌屬、毛殼菌屬、Paraphaeosphaeria屬和地生梭孢殼屬4個(gè)endprint

屬；接合菌門包括2個(gè)屬，分別為被孢霉屬及毛霉屬，每屬各1株，共11株真菌菌株。棗莊市輕病田分離得到半知菌類及子囊菌門共8株真菌，其中半知菌類包括6個(gè)屬，分別為漆斑霉屬、戴氏霉屬、平臍蠕孢屬、帚枝霉屬、枝頂孢屬、肉座菌屬，子囊菌門包括毛殼菌屬及梭孢殼屬，每屬各包含1株真菌。棗莊重病田共分離得到12株真菌，分屬于四個(gè)大類，分別為半知菌類，包括5個(gè)屬，其中青霉屬有2株，鐮孢屬、鏈格孢屬、綠僵菌屬及曲霉屬各1株；子囊菌門包括3個(gè)屬4株真菌，其中毛殼菌屬2株，暗球腔菌屬和隱囊菌屬各1株，卵菌門的結(jié)合菌屬及接合菌門的毛霉屬各1株。濟(jì)寧市輕病田共分離到4株真菌，其中半知菌類曲霉屬、木霉屬各1株，子囊菌門暗球腔菌屬及接合菌門被孢霉屬各1株。濟(jì)寧重病田共分離到9株真菌，分屬于三大類，其中半知菌類包括6個(gè)屬，分別為鐮孢屬、鏈格孢屬、曲霉屬、平臍蠕孢屬、漆斑霉屬、枝頂孢屬，每屬各含1株真菌；子囊菌門包括2個(gè)屬，分別為毛殼菌屬和旋孢腔菌屬各1株；接合菌門為1株毛霉屬真菌。

對3組病樣地塊的優(yōu)勢真菌菌種統(tǒng)計(jì)可知，臨沂市兩地塊的優(yōu)勢真菌屬為鏈格孢屬和枝孢屬，棗莊市兩地塊的優(yōu)勢菌屬為毛殼菌屬，濟(jì)寧市兩地塊的優(yōu)勢菌屬為曲霉屬。

試驗(yàn)共分離得到40株細(xì)菌菌株，其中臨沂市輕病田僅分離到厚壁菌門1類，包括2個(gè)屬，分別為芽孢桿菌屬共4株，短芽孢桿菌屬1株；臨沂重病田分離到6株細(xì)菌，分別為厚壁菌門的葡萄球菌屬2株及芽孢桿菌屬1株、變形菌門的假黃色單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬各1株、擬桿菌門的土地桿菌屬1株，輕重病田的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。棗莊市輕病田共分離到兩大類細(xì)菌，其中厚壁菌門全部為芽孢桿菌屬，共6株，變形菌門包括3個(gè)屬，分別為泛菌屬、假黃色單胞菌屬和戴氏菌屬，每屬各1株；棗莊市重病田也分離到厚壁菌門和變形菌門兩大類細(xì)菌，其中厚壁菌門包括7株芽孢桿菌屬和2株類芽孢桿菌屬，變形菌門包含泛菌屬的1株細(xì)菌，輕重病田優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。濟(jì)寧市輕病田僅分離到厚壁菌門細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬各2株；濟(jì)寧市重病田分離到厚壁菌門和變形菌門共6株細(xì)菌，其中前者包含芽孢桿菌屬2株、短芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬各1株，后者包含寡養(yǎng)單胞菌屬和多囊菌屬各1株，輕重病田的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬。

試驗(yàn)共分離到34株放線菌。其中臨沂輕病田共分離到2株放線菌，分別為諾卡氏菌科紅球菌屬和微球菌科節(jié)細(xì)菌屬各1株；臨沂重病田共分離到6株放線菌，分別為鏈霉菌科的鏈霉菌屬2株、Microbacteriaceae科的微桿菌屬和Plantibacter屬各1株、微球菌科節(jié)桿菌屬1株及間孢囊菌科海藻球菌屬1株。棗莊輕病田共分離到鏈霉菌科鏈霉菌屬6株和諾卡氏菌科紅球菌屬1株放線菌；棗莊重病田共分離到7株放線菌，分別為鏈霉菌科鏈霉菌屬4株、放線菌科放線菌屬1株、微球菌科節(jié)桿菌屬1株及Pseudonocardiaceae科諾卡菌屬1株。濟(jì)寧輕病田共分離到鏈霉菌科鏈霉菌屬4株及放線菌科放線菌屬1株；濟(jì)寧重病田共分離到7株放線菌，分別為鏈霉菌科鏈霉菌屬3株、放線菌科放線菌屬1株、Pseudonocardiaceae科諾卡菌屬1株、皮生球菌科Flexivirga屬1株及間孢囊菌科海藻球菌屬1株。其中除臨沂輕病田無明顯的優(yōu)勢菌屬，其余地塊的優(yōu)勢菌屬均為鏈霉菌屬。

3 討論與結(jié)論

土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌三大微生物的數(shù)量是反映土壤活性和土壤健康的重要指標(biāo)[11]。本研究以小麥黃花葉病毒病發(fā)生嚴(yán)重度不同地塊的土壤作為對象，研究土壤微生物生態(tài)特征的變化情況。結(jié)果顯示，同一地塊中，土壤微生物總量表現(xiàn)為細(xì)菌>放線菌>真菌，這與李雪萍等[12]對青稞根腐病、徐瑞富等[13]對棉花黃萎病、苗則彥等[7]對黃瓜黃萎病、陸寧海等[10]對玉米莖基腐病的研究結(jié)論相同，但是分離到的可培養(yǎng)微生物數(shù)量及種類呈現(xiàn)真菌>細(xì)菌>放線菌的規(guī)律。張愛梅[14]對沙棘屬植物可培養(yǎng)微生物的研究結(jié)果表明，真菌的個(gè)體數(shù)量雖然比細(xì)菌、放線菌少，但其生物總量卻遠(yuǎn)大于細(xì)菌和放線菌，這可能因?yàn)橐恍┘?xì)菌由于特殊的生物特性而不容易得到純培養(yǎng)。

本研究結(jié)果還表明，3組重度發(fā)病土壤的土壤微生物總量均大于輕度發(fā)病土壤的，其中真菌數(shù)量增加最為明顯，其次為細(xì)菌，放線菌變化不大。徐瑞富[13]、顧美英[15]等的研究表明，重度發(fā)生棉花黃萎病的地塊中真菌數(shù)量明顯高于輕度發(fā)生棉花黃萎病的地塊，與本研究結(jié)果一致。真菌一般耐受性強(qiáng)，當(dāng)細(xì)菌和放線菌發(fā)育受到限制的時(shí)候，真菌仍能較好地發(fā)育生長[14]，這可能是重病田真菌數(shù)量與種類遠(yuǎn)高于輕病田的原因之一；另外，該研究結(jié)果表明輕病田的放線菌數(shù)量明顯高于重病田，與本研究不一致。本研究中小麥黃花葉病毒病重度發(fā)生的地塊微生物數(shù)量增多，說明土壤質(zhì)量下降，土壤環(huán)境的改變誘發(fā)各種微生物的生長和繁殖，同時(shí)病原微生物的大量繁殖也可能侵入寄主后改變植株生理代謝，造成其分泌物中一些成分及含量發(fā)生變化，從而可能導(dǎo)致不同發(fā)病程度的土壤微生物數(shù)量及種類明顯不同。

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