梁珍麗 王熹婧 朱銀川 高靈茜 宋德志 張?jiān)龇?

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，南寧市 530021；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530021)

·論 著·

人體多組織器官EV71病毒受體SCARB2和PSGL-1的分布特點(diǎn)▲

梁珍麗1，2王熹婧1朱銀川1高靈茜1宋德志1張?jiān)龇?*

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，南寧市 530021；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530021)

目的探討人體多組織器官中EV71病毒受體SCARB2和 PSGL-1的分布特點(diǎn)及其意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)中樞神經(jīng)、呼吸道、腸道、肝臟、脾臟、心臟組織EV71病毒受體SCARB2和 PSGL-1的表達(dá)。結(jié)果SCARB2在中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干，呼吸道的喉部、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腸道組織中呈陽性分布，肝臟呈弱陽性或陰性，脾臟、心臟則為陰性，SCARB2受體在中樞神經(jīng)、呼吸道和腸道的分布明顯高于肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)。PSGL-1在中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干，呼吸道的喉部呈陽性分布，呼吸道的氣管、支氣管、腸道呈少量陽性分布，而肺泡細(xì)胞陰性，肝臟、脾臟、心臟為陰性或僅極少量表達(dá)陽性。 PSGL-1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布明顯高于呼吸道、腸道、肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)，PSGL-1受體在呼吸道、腸道的分布明顯高于肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)。結(jié)論在中樞神經(jīng)、呼吸道和腸道表達(dá)的EV71病毒受體SCARB2和/或 PSGL-1，提示上述組織器官是EV71感染的主要部位。

腸道病毒71型；受體；SCARB2； PSGL-1；人

腸道病毒EV71型(enterovirus 71，EV71)感染可引發(fā)嬰幼兒手足口病(hand - foot and mouth disease，HFMD)，嚴(yán)重者伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心肺衰竭，甚至死亡，成為繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后最重要的中樞神經(jīng)毒性病原體之一。EV71感染已成為全球公共健康的新威脅。EV71屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)A組腸道病毒，其基因組為單股正鏈RNA，蛋白外殼為呈對(duì)稱排列的20面體，無包膜。EV71感染引發(fā)人多組織器官特別是中樞神經(jīng)病變，但其感染機(jī)制和感染的靶細(xì)胞仍未清楚。病毒受體是病毒感染宿主的主要因素之一，病毒感染過程的最初、最重要的一步是病毒與位于細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而感染宿主細(xì)胞。因此，病毒結(jié)合的特異性受體分布決定了病毒的宿主范圍和組織細(xì)胞嗜性。現(xiàn)已證實(shí)清道夫受體B2 (human scavenger receptor class B-member 2,SCARB2)[1]與P-選擇素糖蛋白配體-1(human P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)是EV71的特異性受體[2]。本文將EV71結(jié)合的特異性受體作為研究切入點(diǎn)，檢測(cè)全身各組織器官EV71受體的分布特點(diǎn)，進(jìn)而探討EV71感染的靶器官和靶細(xì)胞，為EV71全身各組織器官感染提供分子學(xué)基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、附屬腫瘤醫(yī)院尸檢或手術(shù)切除中樞神經(jīng)、呼吸道、腸道、肝臟、脾臟、心臟標(biāo)本32例，男19例，女13例，年齡0～65歲，中位年齡31歲。各部位組織分布見表1，所選組織均無組織病變和感染病變。組織經(jīng)40%醛溶液固定，梯度乙醇脫水，浸蠟和包埋，連續(xù)石蠟切片，切片厚度4 μm。所選的標(biāo)本均經(jīng)患者、監(jiān)護(hù)人或其家屬知情同意以及廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 采用免疫組化法檢測(cè)EV71病毒受體。將組織切片脫蠟至水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗PSGL-1(1 ∶50)和SCARB2(1 ∶100)(Vector公司產(chǎn)品)，置于4℃冰箱中孵育過夜，然后加二抗(Vector公司產(chǎn)品)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)對(duì)照：用EV71 PSGL-1、SCARB2受體陽性的人大腦組織作陽性對(duì)照、以正常鼠血清代替一抗作陰性對(duì)照，以PBS代替一抗作空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 PSGL-1和SCARB2染色細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒定為陽性。PSGL-1和SCARB2染色結(jié)果評(píng)定參照許良中等[3]的方法，隨機(jī)選5個(gè)高倍視野，按顯色上皮細(xì)胞百分比評(píng)分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按細(xì)胞顯色深淺評(píng)分，細(xì)胞未著色即為0分；著色淺為1分；著色適中為2分；著色深為3分。兩者分?jǐn)?shù)乘積0～3分、4～6分、6～8分、8分以上分別定為PSGL-1和SCARB2染色陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SCARB2受體的分布特點(diǎn) SCARB2陽性信號(hào)為棕黃色，陽性信號(hào)位于細(xì)胞膜。SCARB2在中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干，呼吸道的喉部、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腸道組織中呈陽性分布。見圖1。由圖1可見，肝臟呈弱陽性，脾臟、心肌則為陰性。SCARB2受體在神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和腸道的分布明顯高于肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)。見表1。由此可見，SCARB2受體的分布主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道以及腸道組織中。

圖1 EV71受體SCARB2在中樞神經(jīng)的大腦(A)、小腦(B)、腦干(C)，呼吸道的喉部(D)、氣管(E)、支氣管(F)、肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(G)，腸道上皮細(xì)胞(H)呈陽性分布。(免疫組化法，×400)

表1 人體各部位中SCARB2和PSGL-1受體分布 (n)

注：與肝臟、脾臟、心臟比較，*P<0.05；與呼吸道、腸道、肝臟、脾臟、心臟比較，#P<0.05；與肝臟、脾臟、心臟比較，△P<0.05。

2.2 PSGL-1受體的分布特點(diǎn) PSGL-1陽性信號(hào)為棕黃色，陽性信號(hào)位于細(xì)胞膜上。見圖2。PSGL-1在中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干、呼吸道的喉部呈陽性彌漫分布，在呼吸道的喉部、呼吸道的氣管呈陽性彌漫分布，支氣管、腸道黏膜上皮和腺上皮呈少量陽性分布，而肺泡細(xì)胞陰性，肝臟、脾臟、心臟為陰性或僅極少量表達(dá)陽性。 PSGL-1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布明顯高于呼吸道、腸道、肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)，PSGL-1受體在呼吸道、腸道的分布明顯高于肝臟、脾臟、心臟(P<0.05)。見表1。由此可見，PSGL-1受體的分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈高密度分布，呼吸道、腸道次之，肝臟、脾臟、心臟基本無分布。

圖2 EV71受體PSGL-1在中樞神經(jīng)的大腦(A)、小腦(B)、腦干(C)呈陽性彌漫分布，在呼吸道的喉部(D)呈陽性彌漫分布,氣管(E)、支氣管(F)呈少量陽性表達(dá)，而肺泡細(xì)胞陰性(G)，腸道黏膜上皮和腺上皮(H)呈少量陽性分布。(免疫組化法，×400)

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、腸道PSGL-1和SCARB2受體分布比較 比較中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、腸道PSGL-1和SCARB2受體的總體分布，兩受體的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示人中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、腸道均表達(dá)PSGL-1、SCARB2受體，兩種受體均在EV71感染中起重要作用。

3 討 論

EV71經(jīng)上消化道或呼吸道進(jìn)入人體內(nèi)，引起病毒血癥，并隨血流到達(dá)全身各個(gè)器官，在相應(yīng)的靶器官或組織中復(fù)制，引起一系列病變。EV71感染嚴(yán)重者可伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)中以腦干為主的多部位腦炎，表現(xiàn)為腦組織神經(jīng)元變性、壞死和軟化灶形成、噬神經(jīng)現(xiàn)象、血管套、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)單核巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞彌漫或結(jié)節(jié)狀增生[4]，提示EV71具有高度嗜神經(jīng)性，腦干是其攻擊的主要靶器官[5]。病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)途徑有：通過血液循環(huán)突破血-腦屏障或由外周神經(jīng)通過逆行軸突傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]。病毒與宿主細(xì)胞受體的特異性結(jié)合決定了病毒感染的組織嗜性。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)EV71病毒受體SCARB2和PSGL-1在中樞神經(jīng)的分布，結(jié)果SCARB2和PSGL-1在中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干均呈陽性分布，PSGL-1和SCARB2受體的總體分布無明顯差異。上述結(jié)果與EV71感染嚴(yán)重者出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)、病理變化相一致，表明中樞神經(jīng)的大腦、小腦、腦干是EV71感染的靶組織細(xì)胞。

EV71感染嚴(yán)重者也可表現(xiàn)為肺淤血和不同程度的神經(jīng)源性肺水腫及肺出血，但未見彌漫性肺損傷[4]。手足口病患者肺損傷是EV71感染腦干后的神經(jīng)源性水腫(neurogenic pulmonary edema，NPE)，而不是病毒直接侵入，其原因在于肺和肺損傷組織中未能分離EV71以及炎細(xì)胞浸潤少見[4，7]。但有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道EV71感染嚴(yán)重者出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，可能由病毒感染引起。EV71可通過呼吸道途徑傳播并引發(fā)上呼吸道感染如皰疹性咽峽炎，病毒是否可從上呼吸道傳播至肺組織或通過病毒血癥傳播至肺仍未完全清楚。為證實(shí)EV71是否感染人下呼吸道肺組織，本研究檢測(cè)正常人呼吸道組織EV71 受體分布，結(jié)果顯示，SCARB2在呼吸道的喉部、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呈陽性分布，而PPSGL-1在喉部、氣管、支氣管、細(xì)支氣管及巨噬細(xì)胞呈少量陽性分布，肺泡細(xì)胞陰性，結(jié)果與Jiao等[10]報(bào)道類似。肺組織內(nèi)表達(dá)EV71受體SCARB2和PSGL-1，肺泡細(xì)胞SCARB2陽性而PSGL-1陰性，提示EV71可感染肺組織，呼吸道是其感染途徑之一，SCARB2受體在EV71感染肺組織過程中起到更為重要的作用。本文研究結(jié)果顯示，人肺組織表達(dá)EV71 SCARB2和PPSGL-1受體，提示EV71引起的肺損傷，除神經(jīng)源性外，病毒也可能先從上呼吸道感染開始，然后逐漸蔓延至下呼吸道，進(jìn)而感染肺組織所致。腸道組織中，腸上皮細(xì)胞均表達(dá)PSGL-1和SCARB2受體，提示EV71可在腸上皮細(xì)胞復(fù)制，消化道也是其感染途徑。

SCARB2受體在中樞神經(jīng)、呼吸道和腸道的分布明顯高于肝臟、脾臟、心臟；PSGL-1受體在中樞神經(jīng)呈高密度分布，呼吸道、腸道次之，肝臟、脾臟分布最少。因此，感染EV7l重癥病例屬全身病毒感染性病例，中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)(包括肺組織)和腸道是EV71攻擊的主要靶組織，特別是中樞神經(jīng)，此類重癥患兒因中樞神經(jīng)損傷、神經(jīng)源性損傷和/或肺組織直接感染致肺損傷，甚至呼吸循環(huán)衰竭而死亡。本研究結(jié)果為研究EV7l引發(fā)重癥手足口病的致病機(jī)制提供了分子學(xué)基礎(chǔ)。

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DistributioncharacteristicsofEV71receptorsSCARB2andPSGL-1inmultiplehumantissuesandorgans

LIANGZhenli1,2,WANGXijing1,ZHUYinchuan1,GAOLingxi1,SONGDezhi1,ZHANGZengfeng1

(1DepartmentofMicrobiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China;2GuangxiCenterforDiseasePreventionandControl,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveTo explore the distribution characteristics and its significance of EV71 receptors SCARB2 and PSGL-1 in multiple human tissues and organs.MethodsThe expressions of EV71 receptor SCARB2 and PSGL-1 in the tissues of central nervous system, respiratory tract, intestinal tract, liver, spleen and heart were detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive expression of SCARB2 was observed in the cerebrum, cerebellum and brain stem of the central nervous system, throat, trachea, bronchus, bronchioles, alveolar cells and macrophages of respiratory tract and intestinal tissues, the weakly positive or negative expression in the liver, and the negative expression in the spleen and heart. The expression levels of SCARB2 in the central nervous system, respiratory tract or intestinal tract was significantly higher in that in the liver spleen or heart(P<0.05). The positive expression of PSGL-1 was observed in the cerebrum, cerebellum and brain stem of the central nervous system and the throat of respiratory tract, the weakly positive expression in the trachea and bronchus of the respiratory tract and intestinal tract, the negative expression in the alveolar cell, and the negative or extremely weakly positive expression in the liver, spleen and heart. The expression level of PSGL-1 in the central nervous system was significantly higher than that in the respiratory tract, intestine, liver, spleen or heart(allP<0.05). The expression level of PSGL-1 in the respiratory tract or intestine was significantly higher than that in the liver, spleen or heart(allP<0.05).ConclusionThe EV71 receptor SCARB2 and/or PSGL-1 expressed in the central nervous system, respiratory tract and intestinal tract, which suggests that those organs and tissues above are the main sites EV71 infected.

Enterovirus 71; Receptor; SCARB2; PSGL-1; Human

廣西自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014GXNSFAA118200)

*通信作者

R 373.25

A

1673-6575(2017)06-0737-04

10.11864/j.issn.1673.2017.06.02

2017-08-27

2017-10-23)