徐 匯 鄭俊媛 范俊杰 黃春蘭 曾 悅

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(201620)

MUC2轉(zhuǎn)錄下調(diào)對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸道通透性的影響*

徐 匯#鄭俊媛 范俊杰 黃春蘭&曾 悅&

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(201620)

急性胰腺炎早期即可出現(xiàn)腸屏障功能障礙，并與疾病進(jìn)展、預(yù)后有密切聯(lián)系。腸黏液層作為主要腸道物理屏障之一，有助于維持正常腸屏障功能。目的觀察黏蛋白MUC2在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸道中的表達(dá)變化，探討其在ANP腸屏障損傷中的作用。方法42只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)和ANP組，后者以胰膽管逆行注射3.5%?；悄懰徕c建立ANP模型。分別于造模后6 h、12 h、24 h獲取標(biāo)本，測(cè)定血清淀粉酶和D-乳酸(反映腸道通透性)水平，觀察胰腺和結(jié)腸組織病理學(xué)改變，PAS/AB染色觀察結(jié)腸黏液層和杯狀細(xì)胞，real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸組織MUC2和促炎細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果ANP大鼠模型建立成功。ANP組結(jié)腸組織損傷明顯；與SO組同時(shí)間點(diǎn)相比，ANP組腸道通透性增加，結(jié)腸黏液層變薄，含黏液杯狀細(xì)胞數(shù)減少，MUC2 mRNA表達(dá)下調(diào)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、干擾素-γ(IFN-γ) mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ANP組MUC2表達(dá)與腸道通透性和促炎細(xì)胞因子表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論ANP大鼠結(jié)腸組織MUC2轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，并與腸道通透性增加和病程早期促炎細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)。

胰腺炎，急性壞死性； 黏蛋白-2； 杯狀細(xì)胞； 腸道通透性

重度急性胰腺炎的最終死亡原因與多器官功能衰竭綜合征(MODS)、胰腺/胰周壞死感染密切相關(guān)[1-2]。研究表明急性胰腺炎早期即可出現(xiàn)腸屏障功能障礙、腸道通透性增加、腸道細(xì)菌易位和腸源性內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而促進(jìn)多器官功能衰竭發(fā)生，與疾病進(jìn)展、預(yù)后有密切聯(lián)系[3-6]，但腸道通透性增加在此種疾病狀態(tài)下的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。

正常腸道屏障由物理屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障組成，腸道上皮細(xì)胞表面覆蓋的膠樣黏液層是腸道主要物理屏障之一，可隔絕病原菌與腸上皮細(xì)胞接觸，并有助于維持正常腸屏障功能。黏蛋白MUC2是腸黏液層最主要的成分，由杯狀細(xì)胞合成、分泌。本研究旨在觀察急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠模型腸道中MUC2蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化，探討其在ANP腸屏障損傷中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠42只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。牛磺膽酸鈉(Sigma-Aldrich Co.)；D-乳酸檢測(cè)試劑盒(比色法)(Abcam plc.)；TRIzolTM試劑(Thermo Fisher Scientific)；real-time PCR試劑盒(TAKARA BIO INC.)。

二、方法

1. 動(dòng)物分組和ANP模型制備：42只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(SO)組和ANP組，每組按標(biāo)本獲取時(shí)間(造模后6 h、12 h、24 h)進(jìn)一步分為3個(gè)亞組。造模前12 h開始禁食，自由飲水。ANP組大鼠1%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹正中切口進(jìn)入腹腔，顯露胰膽管，以血管夾阻斷近肝門處胰膽管，使用4號(hào)頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近經(jīng)十二指腸壁穿刺，逆行插入胰膽管，沿胰膽管逆行恒速(0.1 mL/min)注射3.5%?；悄懰徕c溶液1 mL/kg。注射完畢后，針頭保留5 min 后拔出，除去血管夾，關(guān)腹。SO組大鼠常規(guī)麻醉、開腹后僅翻動(dòng)胰腺，隨即關(guān)腹。

2. 標(biāo)本獲?。簝山M分別于造模后6 h、12 h、24 h取材，每一時(shí)點(diǎn)7只大鼠。動(dòng)物麻醉后腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min分離血清，分裝后-70 ℃凍存。動(dòng)物處死后切取胰腺組織，4%甲醛溶液固定；取距肛門8 cm處結(jié)腸組織，分為3份，一份4%甲醛溶液固定，一份Carnoy固定液(60%甲醇+30%氯仿+10%冰乙酸)固定，一份液氮速凍后-70 ℃保存。

3. 胰腺和結(jié)腸組織病理學(xué)檢查：胰腺和結(jié)腸組織4%甲醛溶液固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。參照Schmidt等[7]采用的方法對(duì)胰腺組織損傷進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，總分為水腫、出血、壞死、炎癥四項(xiàng)評(píng)分之和。

4. 血清淀粉酶檢測(cè)：采用Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清淀粉酶水平。

5. 腸道通透性檢測(cè)：參照試劑盒說(shuō)明書，采用比色法測(cè)定血清D-乳酸水平。

6. 結(jié)腸黏液層和杯狀細(xì)胞觀察：結(jié)腸組織在室溫下置于Carnoy固定液中固定4 h～2 d，甲醇脫水30 min×2次，乙醇脫水20 min×2次，二甲苯脫水15 min×2次，石蠟包埋、切片，PAS/AB染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏液層。參照J(rèn)ohansson等[8]采用的方法，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)縱切面上距表面上皮100 μm的隱窩中陽(yáng)性染色杯狀細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以平均每個(gè)隱窩中含黏液的杯狀細(xì)胞數(shù)表示。

7. 結(jié)腸組織MUC2和促炎細(xì)胞因子檢測(cè)：采用real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸組織MUC2和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、干擾素-γ(IFN-γ)mRNA表達(dá)。取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織100 mg，TRIzolTM試劑抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行real-time PCR擴(kuò)增。MUC2、TNF-α、IL-1β、IFN-γ PCR引物序列見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 Real-time PCR引物序列

結(jié) 果

一、胰腺和結(jié)腸組織病理學(xué)改變

1. 胰腺組織：光學(xué)顯微鏡觀察顯示，SO組胰腺組織完整，腺泡結(jié)構(gòu)清晰，偶見(jiàn)輕度葉間隙增寬和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)出血、壞死，各時(shí)間點(diǎn)間病理學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1A、1B)。ANP組胰腺組織可見(jiàn)間質(zhì)水腫、小葉間隙增寬，腺泡細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，病理學(xué)評(píng)分逐漸增高；24 h 時(shí)可見(jiàn)部分小葉結(jié)構(gòu)破壞，片狀出血和壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)評(píng)分顯著高于12 h和6 h(P<0.05)(圖1A、1B)。ANP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分均較SO組同時(shí)間點(diǎn)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

2. 結(jié)腸組織：光學(xué)顯微鏡觀察顯示，SO組結(jié)腸組織形態(tài)正常，黏膜層表面光滑，上皮細(xì)胞層完整，未見(jiàn)炎癥表現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)間未見(jiàn)明顯變化；ANP組結(jié)腸黏膜上皮和固有層腺體排列紊亂，可見(jiàn)部分上皮細(xì)胞脫落、缺損和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩數(shù)減少，間質(zhì)水腫，損傷隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，24 h時(shí)損傷最為明顯(圖2)。

*兩組間比較，P<0.05

圖2 SO組和ANP組結(jié)腸組織病理學(xué)改變比較(HE染色，×400)

二、血清淀粉酶變化

與SO組相比，ANP組各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ANP組血清淀粉酶水平于12 h達(dá)高峰，但6 h、12 h、24 h間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

三、腸道通透性變化

ANP組血清D-乳酸水平于6 h開始逐漸增高，于24 h達(dá)高峰，6 h、12 h、24 h間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于SO組同時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

*兩組間比較，P<0.05

*兩組間比較，P<0.05

四、結(jié)腸黏液層和杯狀細(xì)胞變化

結(jié)腸組織PAS/AB染色后光學(xué)顯微鏡觀察顯示，SO組結(jié)腸黏膜上皮被一層完整的黏液層覆蓋，杯狀細(xì)胞內(nèi)充滿黏液顆粒，不同時(shí)間點(diǎn)間未見(jiàn)明顯變化；ANP組6 h時(shí)即可觀察到部分腸黏液層缺失，隱窩內(nèi)含黏液的杯狀細(xì)胞數(shù)減少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腸黏液層變薄更為明顯，完整性破壞，杯狀細(xì)胞中黏液明顯減少(圖5A)。ANP組各時(shí)間點(diǎn)含黏液杯狀細(xì)胞數(shù)均較SO組同時(shí)間點(diǎn)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但組內(nèi)6 h、12 h、24 h間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5B)。

五、結(jié)腸組織MUC2和促炎細(xì)胞因子表達(dá)變化

與SO組相比，ANP組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸組織MUC2 mRNA均呈低表達(dá)(P<0.05)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，但組內(nèi)6 h、12 h、24 h間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6A)。

ANP組結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA 6 h時(shí)表達(dá)最高，隨后呈降低趨勢(shì)，其中IL-1β、IFN-γ mRNA 6 h與12 h、24 h間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但各時(shí)間點(diǎn)仍較SO組同時(shí)間點(diǎn)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6B-D)。

六、ANP組MUC2表達(dá)與腸道通透性、促炎細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系

相關(guān)性分析顯示，ANP組結(jié)腸組織MUC2 mRNA表達(dá)與血清D-乳酸水平和結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)(表2)。

表2ANP組結(jié)腸組織MUC2表達(dá)與腸道通透性、促炎細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)分析)

指標(biāo)MUC2mRNAr值P值血清D?乳酸-0．790<0．05TNF?αmRNA-0．803<0．05IL?1βmRNA-0．619<0．05IFN?γmRNA-0．611<0．05

*兩組間比較，P<0.05

*兩組間比較，P<0.05

討 論

急性胰腺炎是一種臨床常見(jiàn)的急腹癥，其中重度急性胰腺炎常伴有持續(xù)性器官功能衰竭，病死率高達(dá)20%～30%。ANP的進(jìn)展與腸屏障功能障礙有密切聯(lián)系，腸道通透性增加，腸道菌群易位，內(nèi)毒素入血，加重ANP病情。研究顯示腸屏障損傷程度與MODS的發(fā)生和死亡率呈顯著正相關(guān)[4-5]。本研究以胰膽管逆行注射3.5%?；悄懰徕c建立ANP大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物血清D-乳酸水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，提示腸道通透性增加，同時(shí)結(jié)腸組織病理學(xué)改變逐漸加重，與Liang等[3]的發(fā)現(xiàn)一致。既往研究認(rèn)為ANP合并腸屏障損傷與微循環(huán)障礙、缺血再灌注損傷、炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放等系統(tǒng)性因素有關(guān)[6]，但確切機(jī)制仍未明確。

腸道上皮表面的黏液層作為主要物理屏障，可隔絕腸道致病菌和有害物質(zhì)與腸上皮細(xì)胞直接接觸。腸黏液層的主要組成成分是由杯狀細(xì)胞合成、分泌的黏蛋白MUC2?，F(xiàn)有證據(jù)表明腸黏液層具有重要屏障作用，Muc2-/-小鼠腸道含黏液杯狀細(xì)胞和腸腔內(nèi)黏液層缺如，細(xì)菌直接接觸腸上皮細(xì)胞甚至進(jìn)入上皮細(xì)胞和隱窩內(nèi)部，可發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎甚至進(jìn)展至結(jié)腸癌[9]。對(duì)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者的研究[8]亦發(fā)現(xiàn)患者結(jié)腸活檢標(biāo)本中可觀察到細(xì)菌穿透黏液層與上皮細(xì)胞接觸，這一現(xiàn)象可能與含黏液杯狀細(xì)胞和黏液產(chǎn)生減少有關(guān)[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腸道缺血再灌注損傷中，腸黏液層狀態(tài)與腸道通透性密切相關(guān)，黏液層不僅充當(dāng)腸腔內(nèi)容物與表面上皮之間的屏障，在腸屏障功能的維持和恢復(fù)中亦起有關(guān)鍵作用[11]。因此，腸黏液層對(duì)腸屏障功能的維護(hù)作用不可忽視。本研究通過(guò)PAS/AB染色觀察到ANP大鼠結(jié)腸黏液層明顯變薄甚至部分缺失，隱窩內(nèi)含黏液杯狀細(xì)胞數(shù)減少，上述改變隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，與結(jié)腸組織中的MUC2 mRNA表達(dá)變化相符。相關(guān)性分析顯示，ANP大鼠結(jié)腸組織MUC2 mRNA表達(dá)與腸道通透性(血清D-乳酸水平)呈顯著負(fù)相關(guān)。由此認(rèn)為MUC2對(duì)ANP時(shí)的腸屏障損傷起重要保護(hù)作用。關(guān)于ANP時(shí)MUC2 mRNA表達(dá)下調(diào)是否是腸道通透性增加的原因之一，后續(xù)研究擬通過(guò)增加ANP造模后更早期的觀察時(shí)間點(diǎn)，以及預(yù)先使用黏液耗竭劑加以證實(shí)。

研究[12]顯示急性胰腺炎早期在腸道病理?yè)p傷前即已出現(xiàn)腸黏液層破壞或缺失以及腸道通透性增加，并發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體機(jī)制不明。本研究檢測(cè)了ANP大鼠結(jié)腸組織中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，6 h時(shí)即達(dá)到高峰，其后略有下降；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)這些促炎細(xì)胞因子 mRNA表達(dá)均與MUC2 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。既往研究[13]顯示TNF-α可通過(guò)激活JNK信號(hào)通路抑制MUC2基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制MUC2蛋白表達(dá)。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)在沙門菌感染腸炎小鼠中，黏蛋白降解可顯著加重結(jié)腸損傷，上調(diào)結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6等)mRNA表達(dá)，分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞數(shù)與IFN-γ mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)和本研究結(jié)果均表明腸道促炎細(xì)胞因子與MUC2之間存在一定相關(guān)性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ANP大鼠結(jié)腸組織損傷明顯，腸道通透性增加，腸黏液層變薄，含黏液杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少，MUC2 mRNA表達(dá)下調(diào)，并與腸道通透性增加和病程早期促炎細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)，表明杯狀細(xì)胞分泌的MUC2可能參與了ANP時(shí)的腸屏障損傷。本研究的不足之處在于僅提示MUC2與腸道通透性和促炎細(xì)胞因子表達(dá)之間存在相關(guān)性，其中的具體機(jī)制和因果關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。保護(hù)腸黏液層可能在一定程度上減輕腸屏障損傷，在臨床治療層面為改善重度急性胰腺炎的預(yù)后提供了新的策略。

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EffectofDown-regulatedMUC2TranscriptiononIntestinalPermeabilityinRatsWithAcuteNecrotizingPancreatitis

XUHui,ZHENGJunyuan,FANJunjie,HUANGChunlan,ZENGYue.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(201620)

Co-correspondencetoHUANG Chunlan, Email: huangchl@hotmail.com; ZENG Yue, Email: carrie@medmail.com.cn

Background: Acute pancreatitis can induce intestinal barrier dysfunction in its early phase, which is closely related with the progression and prognosis of the disease. Intestinal mucus layer not only serves as a physical barrier between pathogens and epithelium, but also plays a critical role in the maintenance of intestinal barrier function.AimsTo investigate the expression and role of mucin 2 (MUC2) in injured intestinal barrier in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups: the sham operation (SO) group and ANP group, which were induced via a retrograde injection of 3.5% sodium taurocholate into biliopancreatic duct. Blood, pancreas and colon samples were obtained 6, 12 and 24 hours after establishing the ANP model for determination of serum amylase and D-lactate (an indicator of intestinal permeability) and histopathological examination. PAS/AB staining was used to observe the colon mucus layer and goblet cells, and the expressions of MUC2 and inflammatory cytokines in colonic tissue were detected by real-time PCR.ResultsANP models were successfully established. In ANP group, obvious colonic injury, increased intestinal permeability, thinner colon mucus layer, reduced mucin-containing goblet cells, down-regulated MUC2 mRNA and up-regulated tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interferon-γ (IFN-γ) mRNAs were observed at each time point as compared with those in SO group (P<0.05). Spearman correlation coefficient revealed that MUC2 expression was negatively correlated with the intestinal permeability and expression of inflammatory cytokines in ANP group (P<0.05).ConclusionsTranscription of MUC2 is significantly down-regulated in colonic tissue of ANP rats, and might be associated with increased intestinal permeability and excessive expression of inflammatory cytokines in early phase of ANP.

Pancreatitis, Acute Necrotizing; Mucin-2; Goblet Cells; Intestinal Permeability

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.12.003

上海交通大學(xué)“醫(yī)工交叉研究基金”面上項(xiàng)目(YG2015MS29)

#Email: xuhuijy@126.com

&本文共同通信作者：黃春蘭，Email: huangchl@hotmail.com；曾悅，Email: carrie@medmail.com.cn

(2017-06-12收稿；2017-07-11修回)