景富春 張 軍 王進海 馮 誠 楊寶德 胡 浩, 孫曉明 鄭建云 尹曉然 年媛媛

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(710004) 延安大學(xué)附屬寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心4西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科5

天麻素對焦慮樣胃高敏感FD模型大鼠胃敏感性和焦慮樣行為的影響

景富春1,2*張 軍1#王進海1馮 誠1楊寶德3胡 浩3,4孫曉明4鄭建云5尹曉然1年媛媛1

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(710004)延安大學(xué)附屬寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心4西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科5

伴焦慮癥狀并以胃高敏感為主的功能性消化不良(FD)是臨床治療的難點之一，天麻素(Gas)可能具有調(diào)節(jié)胃敏感性和焦慮樣行為的雙重作用。目的探討Gas對焦慮樣胃高敏感FD模型大鼠胃敏感性和焦慮樣行為的影響。方法將40只新生幼鼠隨機分為對照組、模型組、丁螺環(huán)酮組、Gas低劑量組和Gas高劑量組。序貫采用母嬰分離、急性胃刺激和束縛應(yīng)激法制作焦慮樣胃高敏感大鼠模型。第8周，對照組和模型組大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液2.0 mL/kg，丁螺環(huán)酮組給予丁螺環(huán)酮3.125 mg/kg，Gas低、高劑量組分別給予62.5 mg/kg和125.0 mg/kg Gas，連續(xù)7 d。末次給藥后行高架十字迷宮(EPM)試驗、曠場試驗、腹壁回撤反射(AWR)和肌電圖(EMG)。結(jié)果與對照組相比，EPM試驗示模型組大鼠進入開放臂次數(shù)的比例、開放臂停留時間的比例均顯著降低(P<0.01)，曠場試驗示虛擬中央格停留時間明顯縮短(P<0.05)、穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯減少(P<0.01)；胃氣囊擴張壓力為40 mm Hg或以上時，AWR評分顯著升高(P<0.05)，EMG的ROC曲線下面積(AUC)明顯增加(P<0.01)。而與模型組相比，高、低劑量Gas均可明顯改善上述指標(biāo)(P<0.05)。結(jié)論Gas對焦慮樣胃高敏感FD模型大鼠腦-胃軸調(diào)節(jié)中胃敏感性和焦慮樣行為具有明顯的影響。

天麻素； 焦慮； 胃高敏感； 消化不良

功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)以反復(fù)發(fā)作的餐后飽脹不適、早飽不適、中上腹痛等為主要表現(xiàn)，常伴焦慮、抑郁等精神心理癥狀而又缺乏胃腸和神經(jīng)系統(tǒng)的器質(zhì)性病變。腦-胃腸軸的互動調(diào)節(jié)以及精神心理障礙在FD發(fā)病中占有極其重要的地位，是目前診治的主要方向[1]。但目前對腦-腸軸的關(guān)注甚多，對腦-胃軸的研究少見。從腦-胃軸與精神心理和藥物作用之間的關(guān)系來看，一方面胃敏感性增高是FD療效差且易于復(fù)發(fā)的重要原因，也是餐后上腹痛等癥狀的始動因素之一[2-3]。另一方面，焦慮、抑郁等精神心理癥狀可見于約40%～90%的FD患者中，對胃高敏感等的發(fā)生具有重要促進作用[4]。因此，通過改善焦慮癥狀或降低胃敏感性，均有可能產(chǎn)生抗FD作用。

天麻素(gastrodin, Gas)是中藥天麻中的一種生物活性物質(zhì)[5]，具有調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的作用，在精神心理障礙以及內(nèi)臟感覺、運動感覺中發(fā)揮重要作用。本研究的前期臨床觀察[6]發(fā)現(xiàn)Gas對伴焦慮、抑郁癥狀的FD患者有一定治療作用，但其是否通過同時改善焦慮和降低內(nèi)臟敏感性起作用尚不清楚。本研究通過將Gas用于焦慮樣胃高敏感FD大鼠模型，旨在探討Gas對FD模型大鼠腦-胃軸調(diào)節(jié)中胃敏感性和焦慮樣行為的影響，從而為闡明Gas藥理多效性和抗FD治療的機制提供一定依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物、試劑儀器

1. 實驗動物：雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)幼鼠40只，體質(zhì)量3～5 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。母嬰同籠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部機能實驗中心。

2. 主要試劑和儀器：碘乙酰胺購自上海麥克林生化科技有限公司，Gas購自昆明制藥集團公司，丁螺環(huán)酮購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司。PMT-100型大鼠高架十字迷宮(EPM)由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。曠場試驗裝置為自制，箱高30 cm，底邊長100 cm，底面平均分為5個20 cm×20 cm的虛擬小方格。大鼠束縛應(yīng)激裝置為自制的長15 cm、直徑 6 cm的塑料圓筒，兩端自由通氣。生物機能實驗系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的BL-420S及其配套軟件TM-WAVE。

二、動物分組和造模

1. 動物分組：將40只幼鼠隨機分為5組：對照組、模型組、丁螺環(huán)酮組、Gas低劑量組和Gas高劑量組，每組8只。

2. 母嬰分離法[7]：除對照組外，各組幼鼠自出生第2日起，每日與母鼠分離3 h(上午9:00～12:00)，第21日結(jié)束。對照組母嬰同籠飼養(yǎng)。所有幼鼠自出生第22日斷奶，并與母鼠完全分離。

3. 急性胃刺激法[8]：除對照組外，其余各組幼鼠于出生第10日起，每日采用含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液0.2 mL灌胃，對照組僅用等容積2%蔗糖溶液灌胃，連續(xù)6 d。

4. 束縛應(yīng)激法[9]：第8周，每日將大鼠放入束縛應(yīng)激裝置內(nèi)，持續(xù)90 min后放回原籠，連續(xù)1周。

5. 給藥：束縛應(yīng)激試驗結(jié)束后，對照組和模型組腹腔內(nèi)注射等容積0.9% NaCl溶液2.0 mL/kg，Gas低劑量組和高劑量組分別腹腔注射62.5 mg/kg和125.0 mg/kg Gas，丁螺環(huán)酮組腹腔注射3.125 mg/kg丁螺環(huán)酮，連續(xù)7 d。

三、模型評價方法

1. EPM試驗[10]：將大鼠置于EPM中央?yún)^(qū)、面向?qū)嶒炚邔?cè)的開放臂，同時開啟視頻攝像追蹤系統(tǒng)，計時5 min，記錄大鼠進入開放臂和閉合臂的次數(shù)、停留時間。每只大鼠實驗結(jié)束后將實驗儀器四臂以10%乙醇清潔，消除不同動物氣味的干擾。

2. 曠場試驗[11]：將大鼠置于反應(yīng)箱底部虛擬中央格處并立即開始計時，記錄5 min內(nèi)大鼠在中央格的停留時間、穿行格數(shù)、直立次數(shù)和修飾行為。每只大鼠試驗結(jié)束后均用10%乙醇清潔反應(yīng)箱內(nèi)壁和底面，以消除上次動物糞便、氣味的影響。

3. 胃氣囊和電極植入術(shù)[12]：術(shù)前禁食一晚。大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，于左側(cè)腹部切開，暴露胃，將固定于PE240導(dǎo)管的氣囊插入胃內(nèi)并確保無幽門梗阻。然后緊密結(jié)扎胃底切口以防胃液漏入腹腔。將消毒過的不銹鋼電極線植入肩斜方肌(頸部表淺肌肉)，縫合切口。

4. 腹壁回撤反射(AWR)：氣囊植入術(shù)后第6日行AWR，壓力梯度定為20、40、60、80、100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，每個壓力持續(xù)20 s，間隔2 min[13]。參照Liu等[8]的研究，AWR評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，對胃擴張無行為反應(yīng)；1分，簡單頭部運動；2分，腹肌收縮；3分，腹部抬高；4分，軀體弓形，骨盆抬高或身體扭伸。

5. 肌電圖(EMG)[12]：采集基線數(shù)據(jù)，然后分別記錄不同胃氣囊充氣壓力梯度下的EMG，并將所獲原始數(shù)據(jù)計算ROC曲線下面積(AUC)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、焦慮樣行為變化

1. EPM試驗：與對照組相比，模型組大鼠進入開放臂次數(shù)的比例、開放臂停留時間的比例均顯著降低(P<0.05)，表明模型組大鼠表現(xiàn)出了焦慮樣行為。而與模型組相比，Gas高、低劑量組大鼠上述兩個指標(biāo)均明顯增加(P<0.05)；丁螺環(huán)酮組表現(xiàn)出與Gas類似的作用(P<0.05)(表1)。

2. 曠場試驗：與對照組相比，模型組大鼠在中央格停留時間明顯縮短(P<0.05)、穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯減少(P<0.01)，但在修飾行為方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示模型組大鼠表現(xiàn)出了焦慮樣行為，與EPM試驗結(jié)果一致。而與模型組相比，Gas高、低劑量組大鼠在中央格停留時間明顯延長、穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯增加(P<0.05，P<0.01)；丁螺環(huán)酮組表現(xiàn)出與Gas類似的效應(yīng)(P<0.05，P<0.01)(表2)。

二、胃敏感性變化

1. AWR：與對照組相比，擴張壓力為40 mm Hg或以上時，模型組AWR評分顯著升高(P<0.05，P<0.01)，表明大鼠對胃擴張刺激的敏感性明顯增高。與模型組相比，擴張壓力為40 mm Hg或以上時，Gas高、低劑量組AWR評分顯著降低(P<0.05，P<0.01)。丁螺環(huán)酮具有類似的效果(P<0.05，P<0.01)(表3)。

2. EMG：與對照組相比，擴張壓力為40 mm Hg或以上時，模型組肩斜方肌EMG的AUC顯著增加(P<0.01)，表明大鼠對胃擴張刺激的敏感性明顯增高。而與模型組相比，擴張壓力為40 mm Hg或以上時，Gas高、低劑量組AUC顯著降低(P<0.01)。丁螺環(huán)酮具有類似的效果(P<0.01)(表4)。

表1 各組大鼠EPM結(jié)果比較

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

討 論

腦-胃腸軸的互動調(diào)節(jié)和精神心理障礙在FD發(fā)病中起有重要作用[1]。有研究表明胃敏感性增高是FD的主要發(fā)病機制之一，而焦慮、抑郁等精神心理障礙在FD患者中不僅發(fā)生率高，還促進了胃高敏感的發(fā)生和發(fā)展[3,14]，是FD難治和易于復(fù)發(fā)的重要原因。有鑒于此，尋找具有抗焦慮和降低胃敏感性的雙重作用且對腦-胃軸有重要調(diào)節(jié)作用的抗FD藥物是臨床和基礎(chǔ)研究的方向之一。

表2 各組大鼠曠場試驗結(jié)果比較

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

表3 各組大鼠AWR評分比較

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表4 各組大鼠EMG的AUC比較

*與對照組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.01

既往研究顯示，Gas可調(diào)節(jié)大鼠紋狀體內(nèi)γ-氨基丁酸(GABA)[15]、脊髓中腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)[13,16]和海馬內(nèi)5-羥色胺(5-HT)[17]等神經(jīng)遞質(zhì)含量，而這些神經(jīng)遞質(zhì)與腦-胃軸調(diào)節(jié)焦慮、抑郁等精神心理障礙以及內(nèi)臟感覺等內(nèi)臟功能調(diào)控密不可分。Gas對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙所致大鼠焦慮樣行為有改善作用[18]，對病理狀態(tài)下出現(xiàn)的內(nèi)臟痛等有鎮(zhèn)痛作用[19-20]，本研究的前期臨床觀察[6]也發(fā)現(xiàn)Gas對伴焦慮、抑郁癥狀的FD患者有一定治療作用。上述研究結(jié)果表明Gas可能具有抗焦慮和調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺等作用，但其是否通過同時改善焦慮和降低內(nèi)臟敏感性起作用尚不明確。

多項研究表明，幼年的不良生理或心理刺激以及成年后急性應(yīng)激反應(yīng)均參與了FD癥狀的形成[21-22]，而這些不良刺激也可同時引起動物成年后的焦慮樣癥狀和行為[23-24]，影響成年動物的胃敏感性、攝食量和胃容受性舒張功能[8]。據(jù)此，本研究采用幼年時期給予母嬰分離、急性胃刺激和成年后給予束縛應(yīng)激來制作焦慮樣胃高敏感大鼠FD模型，進而探討Gas對模型大鼠胃敏感性和焦慮樣行為的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠在EPM試驗中向開放臂探索的次數(shù)和在開放臂停留的時間均明顯減少，在曠場虛擬中央格停留的時間明顯縮短、穿行格數(shù)明顯減少，表明存在焦慮樣行為，這一變化較好地模擬了FD患者在臨床上易于出現(xiàn)的焦慮樣癥狀。同時，模型組大鼠在胃氣囊擴張壓力達到40 mm Hg或以上時，AWR評分明顯高于對照組，EMG法亦顯示相同擴張壓下AUC較對照組明顯增加。說明模型組大鼠對胃擴張刺激的敏感性明顯增加，這一變化較好地模擬了FD患者胃敏感性增高的特點。由此可見，本研究誘導(dǎo)的大鼠模型具備了部分FD患者胃敏感性增高和焦慮樣行為的雙重特點。與模型組相比，Gas高、低劑量組大鼠在EPM試驗中進入開放臂的次數(shù)和在開放臂停留時間均明顯增加，在曠場試驗中于虛擬中央格停留時間明顯延長、穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯增加，提示Gas有一定的抗焦慮作用。胃氣囊擴張壓力達到40 mm Hg或以上時，Gas高、低劑量組大鼠AWR評分明顯低于模型組，EMG的AUC亦明顯降低，表明Gas具有明顯降低大鼠對胃擴張刺激的敏感性作用。推測上述作用可能與其影響中樞和外周多種腦胃共有的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子有關(guān)。陽性藥丁螺環(huán)酮具有與Gas類似的效果，驗證了本模型和Gas藥效學(xué)試驗結(jié)果的可靠性。

綜上所述，本研究采用焦慮樣胃高敏感大鼠FD模型，初步探討了Gas對FD大鼠腦-胃軸調(diào)節(jié)中胃敏感性和焦慮樣行為的影響，結(jié)果表明Gas具有一定的抗焦慮和降低胃敏感性的作用，為闡明Gas的作用機制和從中藥入手進行抗FD藥物開發(fā)提供了新的視角，也為Gas用于伴焦慮癥狀的FD患者治療奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

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EffectofGastrodinonGastricSensitivityandAnxiety-likeBehaviorinFDRatsWithAnxiety-likeGastricHypersensitivity

JINGFuchun1,2,ZHANGJun1,WANGJinhai1,FENGCheng1,YANGBaode3,HUHao3,4,SUNXiaoming4,ZHENGJianyun5,YINXiaoran1,NIANYuanyuan1.

1DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofXianJiaotongUniversity,Xian(710004);2DepartmentofDigestiveDiseases,BaojiPeople’sHospitalAffiliatedtoYananUniversity,Baoji,ShaanxiProvince;3DepartmentofPharmacology,HealthScienceCenter,XianJiaotongUniversity,Xian;4BasicMedicalExperimentTeachingCenter,HealthScienceCenter,XianJiaotongUniversity,Xian;5DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXianMedicalUniversity,Xian

ZHANG Jun, Email: jun3z@163.com

Background: Functional dyspepsia (FD) with anxiety and gastric hypersensitivity is still one of the therapeutic difficulties in clinic. Gastrodin (Gas) may have dual effects of modulating gastric sensitivity and anxiety.AimsTo investigate the effect of Gas on gastric sensitivity and anxiety-like behavior in FD with anxiety-like gastric hypersensitivity in rats.MethodsForty rats were randomly divided into control group, model group, buspirone group, low-dose Gas group and high-dose Gas group. Maternal separation, acute gastric irritation and restraint stress were sequentially performed to induce FD model with anxiety-like gastric hypersensitivity. At the 8thweek, rats in control group and model group were intraperitoneally injected with 0.9% NaCl solution 2.0 mL/kg, rats in buspirone group were given buspirone 3.125 mg/kg, and rats in low- and high-dose Gas groups were given 62.5, 125.0 mg/kg Gas, respectively. The course was 7 days. Then elevated plus maze (EPM), open field test, abdominal withdrawal reflex (AWR) and electromyography (EMG) were performed.ResultsCompared with control group, EPM test showed that proportions of open arms entries and duration were significantly decreased (P<0.01); open field test showed that virtual central grids duration (P<0.05), number of virtual grids climbed and times of lifting were significantly decreased (P<0.01)； when gastric balloon dilatation pressure was equal or greater than 40 mm Hg, AWR score, area under ROC curve (AUC) of EMG was significantly increased in model group (P<0.05). Compared with model group, above-mentioned indices in low- and high-dose Gas groups were significantly ameliorated (P<0.05).ConclusionsGas could influence the gastric sensitivity and anxiety-like behavior of the brain-stomach axis regulated anxiety-like gastric hypersensitivity in FD rat model.

Gastrodin; Anxiety; Gastric Hypersensitivity; Dyspepsia

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.12.006

*Email: fleming7798@163.com

#本文通信作者，Email: jun3z@163.com

(2017-06-12收稿；2017-07-21修回)