洪森榮 吳 輝 鐘 露 熊思敏 羅 霞 劉 行

(上饒師范學院生命科學學院，上饒 334001)

黃獨微型塊莖低溫離體保存的轉錄組分析

洪森榮 吳 輝 鐘 露 熊思敏 羅 霞 劉 行

(上饒師范學院生命科學學院，上饒 334001)

以黃獨微型塊莖為材料，進行了4℃低溫離體保存，并對其進行了轉錄組分析。結果表明：原始數(shù)據(jù)進行質量預處理后，對照組(Con25)和處理組(Con4)的reads有效比分別為98.67%和98.69%；對拼接序列去重復后最終得到了219 792個長度大于200 bp的transcripts(177 Mb)和161066個Unigenes(99 Mb)；Unigenes的NR注釋數(shù)目最多的10個物種分別為出芽短梗霉EXF-150、葡萄、可可、水稻粳稻組、無油樟、谷子、出芽短梗霉變種namibiae CBS 147.97、麻瘋樹、短至生黑醋桿菌CBS 110374和無花果擬盤多毛孢w106-1；樣本注釋基因最多的5個KOG是一般的功能預測、信號轉導機制、翻譯后修飾和蛋白質周轉以及伴侶、翻譯和核糖體結構和生物合成、能源生產(chǎn)和轉換；樣本KEGG注釋Unigenes最多的5個pathway分別為碳代謝、氨基酸生物合成、糖酵解途徑、淀粉蔗糖代謝和丙酮酸代謝。注釋到的Unigenes個數(shù)為26 006，注釋到的不同酶數(shù)為1 177，映射到的不同pathway數(shù)為327；樣本基因的功能在Biological Process分類中主要聚集于cellular process和metabiolic process，在Cellular Component分類中主要聚集于cell和cell part，在Molecular Function分類中主要聚集于binding和catalytic activity；在黃獨微型塊莖低溫離體保存中，共獲得164 145個差異表達基因，其中有63 305個基因表達上調，有100 840個基因表達下調；差異表達基因部分極其顯著的GO term有液泡繼承、單鏈斷裂修復、紡錘體伸長、麥芽糖分解代謝過程、甘露糖基轉移酶的活性、甘露糖磷酸轉移酶活性、細胞壁甘露糖蛋白的生物合成過程、G1期細胞有絲分裂周期早期細胞芽和有絲分裂紡錘體定位的建立；差異表達基因部分極其顯著的pathway有原發(fā)性膽汁酸的生物合成、類固醇激素的合成、氯代環(huán)己烷和氯苯降解、雙酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸軟骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黃素代謝。本實驗結果可為黃獨微型塊莖的種質保存和后續(xù)萌發(fā)提供理論依據(jù)。

黃獨；微型塊莖；低溫離體保存；轉錄組分析

黃獨(DioscoreabulbiferaL.)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)多年生藤本植物[1]，其地下塊莖俗稱黃藥子，性平、味苦、有毒[2]。在中醫(yī)治療上，常用來散結消癭、清熱解毒和涼血止血；在臨床上，黃藥子可抗病毒、抗腫瘤，常用來治療甲狀腺疾病和多種癌癥[3～4]。薯蕷屬植物試管苗和大田栽培苗的葉腋內(nèi)一般會形成微型塊莖(也稱珠芽)，可直接食用，是功能性食品和皮膚保護劑[5]，還可用作繁殖材料，可提高繁殖系數(shù)[6]，特別是脫毒微型塊莖可代替脫毒苗用于大田種植[7]。但微型塊莖在大田收獲或試管苗收獲后，容易造成滋生病菌，引起變軟腐爛，特別是試管苗誘導的微型塊莖保存期更短。而微型塊莖的低溫離體保存可解決這個問題。本課題組的研究表明，微型塊莖的低溫離體保存，不但可較好地保存其種質資源，也可打破其休眠、促進其萌發(fā)。因此研究微型塊莖的低溫離體保存具有一定的現(xiàn)實意義。目前，有關薯蕷屬微型塊莖方面的研究大多集中在離體誘導[8]和萌發(fā)生理[9]等方面，而針對其低溫離體保存的研究相對較少，更無見有關微型塊莖低溫離體保存轉錄組測序等方面的研究報道。轉錄組表現(xiàn)的是生物或組織細胞在特定狀態(tài)下的所有RNA的總和，是連接基因組遺傳信息與生物功能蛋白質組的必然紐帶，因而，轉錄組的測序研究成為探究基因結構及功能的基礎[10]。本研究通過對4℃低溫離體保存下黃獨微型塊莖轉錄組的分析，探索黃獨微型塊莖低溫離體保存的機理，并挖掘黃獨微型塊莖低溫離體保存的相關基因，以期為黃獨微型塊莖的種質保存和后期萌發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃獨離體誘導的微型塊莖(由上饒師范學院生命科學學院植物組織培養(yǎng)室提供)。

1.2 方法

1.2.1 黃獨的低溫離體保存

挑選出黃獨離體誘導直徑約0.5 cm的微型塊莖轉移到無菌100 mL三角瓶(空瓶)中，然后進行4℃低溫離體保存。試驗材料分成4℃低溫離體保存處理組(以Con4表示)和25℃常溫離體保存對照組(以Con25表示)，保存60 d后進行轉錄組學分析。

1.2.2 總RNA提取

將樣品液氮研磨，取100 mg細粉加入CLB裂解液(北京艾德萊)，裂解液含20%β-巰基乙醇，立即振蕩混勻，65℃水浴5 min，13 000 r·min-1離心10分鐘，取上清，加入等體積氯仿/異戊醇=25∶24∶1(pH<5.0)，大力振蕩60 s，4 500 r·min-1離心10 min；取上清加入等體積氯仿/異戊醇=24∶1，大力振蕩60 s，4 500r·min-1離心2 min，重復以上步驟直至中間層干凈；取上清，加入2.5倍體積的預冷無水乙醇和0.1倍體積5 mol·L-1乙酸鉀4℃過夜沉淀，12 000 r·min-1離心20 min，棄去上清后用氮吹除去乙醇，用60 μL RNase-Free H2O復溶。

1.2.3 測序

總RNA樣品的質量控制是通過Bioanalyzer 2100(Agilent，Germany)完成的。首先，5 μg總RNA通過Dynabeads Oligo(dT)(Life technologie，USA)進行mRNA捕獲，并進行片段化處理，隨后用SuperScriptⅢ cDNA Synthesis Kit(Life technologies，USA)進行cDNA的反轉錄。進行cDNA末端修復、3′平末端加“A”、Adapters連接反應最終連接至illumina的測序接頭并進行PCR擴增反應。根據(jù)Illumina公司HiSeq SBS Kit and Cluster Kit v4(Illumina,Sandiego)說明制備Total RNA測序文庫。建立的文庫進一步用Qubit 2.0(Life technologies，USA)and Bioanalyzer 2100(Agilent，Germany)進行質量控制。最后，按照Illumina公司Hiseq 2500的操作說明對形成的cDNA文庫進行2×125 bp的高通量測序(測序無生物學重復)，利用CASAVA 1.8軟件進行圖像分析，堿基轉換，并根據(jù)不同的INDEX進行多通路篩選。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)預處理

通過illlumina Hiseq2500的paired-end測序，得到了大量的樣本數(shù)據(jù)。鑒于illlumina Hiseq 2500錯誤率對結果的影響，對原始數(shù)據(jù)進行質量預處理(表1)。原始數(shù)據(jù)進行質量預處理后，對照組(Con25)和處理組(Con4)以及這兩組所有樣本的有效比分別為98.67%、98.69%和98.68%。

2.2 De novo拼接

將黃獨處理組(Con4)和對照組(Con25)2組樣本的有效reads合并，并使用軟件Trinity的paired-end拼接方法進行de novo拼接。對拼接序列去重復，最終得到了219 792個長度大于200 bp的轉錄本，大小177 Mb；取每個Loci下最長的轉錄本作為Unigenes，得到了161 066個Unigenes，大小99 Mb(表2和圖1)。

表1 質量預處理前后數(shù)據(jù)結果

表2 De novo拼接結果

注：N50：將transcript從長到短排序，依次累加transcript堿基數(shù)，當累計堿基數(shù)達到transcript總堿基數(shù)的50%時的transcript的長度，Unigene同；N90以相似的方法統(tǒng)計

Note:The transcript is sorted from long to short,and the base number of the transcript base is accumulated successively.When the cumulative base number reaches 50% of the total base number of transcript,the length of the spliced transcript is N50.The unigene is the same as that of transcript.

2.3 Unigenes與公共數(shù)據(jù)庫比較

將樣本Unigenes與公共數(shù)據(jù)gene進行比較，樣本基因序列分別與SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM、NR和KOG庫進行比對，取相似度>30%，且e<1e-5的注釋，合并基因得到的所有注釋詳細信息(表3)。在NR注釋中，Unigenes注釋上數(shù)目最多的10個物種分別為出芽短梗霉EXF-150、葡萄、可可、水稻粳稻組、無油樟、谷子、出芽短梗霉變種namibiae CBS 147.97、麻瘋樹、短至生黑醋桿菌CBS 110374和無花果擬盤多毛孢w106-1(圖2)。

圖1 Unigenes的長度和GC含量分布Fig.1 Unigenes length and GC content distribution

圖2 黃獨微型塊莖組裝轉錄物與NR數(shù)據(jù)庫比對后的分類分布圖Fig.2 Classification distribution of D.bulbifera L. microtubers assembled Unigenes after comparison with the NR database

表3 注釋統(tǒng)計結果

圖3 Unigenes的KOG功能分類 橫坐標為KOG的25個group的名稱；縱坐標為注釋到該group下的基因個數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例Fig.3 KOG functional classification of unigenes The name of the abscissa is 25 groups KOG,the ordinate is the number of notes to the group gene accounted for the proportion of the total number of gene annotation.

2.4 Unigenes的KOG分類

對預測基因進行KOG功能分類預測：共有23 743個Unigenes被注釋上25種KOG分類(圖3)。注釋上樣本基因最多的5個KOG是一般的功能預測、信號轉導機制、翻譯后修飾和蛋白質周轉以及伴侶、翻譯和核糖體結構和生物合成、能源生產(chǎn)和轉換(表4)。

2.5 Unigenes的KEGG注釋

對Unigenes進行了KEGG注釋，該樣本注釋上Unigenes最多的5個pathway分別為碳代謝、氨基酸生物合成、糖酵解途徑、淀粉蔗糖代謝和丙酮酸代謝(表5)。注釋到的Unigenes個數(shù)為26 006，注釋到的不同酶數(shù)為1 177，映射到的不同pathway數(shù)為327。以ko00190為例，Unigenes注釋上的pathway見圖4。從圖4可知，Unigenes注釋上的基因有NADH dehydrogenase、Succinate dehydrogenase/Fumarate reductase、Cytochrome C reductase、Cytochrome C oxidase、F-type ATPase(Bacteria)、F-type ATPase(Eukaryotes)、V-type ATPase(Eukaryotes)。這些基因主要與能量代謝有關，這表明黃獨微型塊莖的低溫離體保存牽涉到能量代謝有關基因的表達。

表4 注釋上樣本基因最多的5個KOG

圖4 Unigenes注釋上的ko00190 pathway 圖上紅色表示注釋上基因。Fig.4 The ko00190 pathway of Unigene annotation The red on the graph represents the annotation gene.

表5 樣本注釋上Unigenes最多的5個pathway

圖5 Unigenes的GO注釋Fig.5 GO annotation of Unigenes

2.6 Unigenes的GO注釋

對得到的基因進行GO分類，統(tǒng)計基因在Biological Process,Cellular Component,Molecular Function 3個類別的各GO term。此分析是基于blast uniprot的結果(即合并與swissprot和trembl的結果)，利用得到的uniprot號比對GO term。樣本基因的功能在Biological Process分類中主要聚集于cellular process和metabiolic process；在Cellular Component主要聚集于cell和cell part；在Molecular Function分類中主要聚集于binding和catalytic activity(圖5)。

圖6 基因表達值分布盒圖Fig.6 RPKM distribution of transcript

2.7 Transcripts的表達豐度

用拼接得到的所有轉錄本做庫，用序列相似性比對的方法求各轉錄本在各樣本中的表達豐度。對照組(Con25)和處理組(Con4)的reads利用率分別為89.04%和88.34%，其轉錄本表達率則分別為80.85%和88.40%(表6)；對照組(Con25)和處理組(Con4)豐度(RPKM)的Mean分別為3.3和2.44，其總和分別為587 179.88和474 833.1(表7)；對照組(Con25)和處理組(Con4)豐度(RPKM)的分布分別為0-1.5和0-1.0(圖6)。

表6 各樣本reads利用率及轉錄本表達率統(tǒng)計結果

2.8 差異表達基因分析

根據(jù)各樣本基因的表達豐度值做差異表達分析，包括：fold change分析，fisher檢驗，chisq檢驗等差異表達分析；最終結果以fold change為主。雙層過濾篩選差異基因：①FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達差異倍數(shù)進行第一層次的差異基因篩選。②FDR檢驗：一般采用卡方檢驗中的fisher精確檢驗進行p值檢驗，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗方法對p值進行假陽性檢驗，即，通過FDR顯著性參數(shù)進行第二層次的差異基因篩選。在黃獨微型塊莖低溫離體保存中，共獲得164 145個差異表達基因，其中有63 305個基因表達上調，有100 840個基因表達下調。

2.9 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

在差異表達基因的GO和KEGG富集分析中，Con4相對Con25的上調的轉錄本為2 035和110(P≤0.05)以及1 672和84(P≤0.01)；Con4相對Con25的下調的轉錄本為1 795和61(P≤0.05)以及1 341和45(P≤0.01)(表8)。以Con25_Con4的所有差異轉錄本(all)為例，部分極其顯著的GO term有液泡繼承、單鏈斷裂修復、紡錘體伸長、麥芽糖分解代謝過程、甘露糖基轉移酶的活性、甘露糖磷酸轉移酶活性、細胞壁甘露糖蛋白的生物合成過程、細胞有絲分裂周期G1期、早期細胞芽位置、有絲分裂紡錘體定位的建立(表9)。部分極其顯著的pathway有原發(fā)性膽汁酸的生物合成、類固醇激素的合成、氯代環(huán)己烷和氯苯降解、雙酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸軟骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黃素代謝(表10)。ko00190標記差異基因顏色的pathway見圖8。

圖7 差異表達基因量散點圖 采用fold change分析(2倍上調/下調)，包括特異性組織表達差異基因和共組織表達差異基因。Fig.7 The scatter plot of differentially expressed genes Using fold change analysis(2 fold up / down),including differential expression of specific tissues and the expression of genes differentially expressed in tissues.

表8 三類差異轉錄本統(tǒng)計結果

表9 Con25_Con4所有差異轉錄本部分極其顯著的GO term

表10 Con25_Con4所有差異轉錄本部分極其顯著的pathway

圖8 ko00190標記差異基因顏色的pathway 紅色代表注釋上表達上調差異基因；藍色代表注釋上表達下調差異基因；綠色代表既注釋上表達上調差異基因，也注釋上表達下調差異基因；粉色代表只注釋上非差異表達基因。Fig.8 Pathway of ko00190 differential gene signed by color The red color represents the up expression of differential genes; The blue color represents the down expression of differential genes; The green color represents the up and down expression of differential genes; The pink color represents only non differentially expressed genes.

3 討論

本研究對黃獨微型塊莖處理組(Con4)和對照組(Con25)的轉錄組進行了illlumina Hiseq2500的paired-end測序。共獲得160605816 Read和20 236 332 816 Base的原始數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)為158 483 948 Read和19 284 915 778 Base，平均長度為121.68。reads有效率為98.68%。研究表明，此次轉錄組測序數(shù)據(jù)質量較好，可以滿足轉錄組分析的基本要求。

將黃獨微型塊莖處理組(Con4)和對照組(Con25)進行基因表達分析，共獲得164 145個差異表達基因，有100 840個基因表達下調，63 305個基因表達上調。在差異表達基因的GO和KEGG富集分析中，Con4相對Con25的上調的轉錄本為2 035和110(P≤0.05)以及1 672和84(P≤0.01)；Con4相對Con25的下調的轉錄本為1 795和61(P≤0.05)以及1 341和45(P≤0.01)。這說明黃獨微型塊莖在4℃低溫離體保存的過程中，其主要以下調基因和上調基因協(xié)同表達的模式來同時應答低溫離體保存，且上調和下調基因表達數(shù)沒有顯著性差異?？购晕骱JSS1和冷敏感西葫蘆SS3低溫響應有613個差異表達基因檢測到，其中612個差異表達基因顯示相同的差異表達模式(308個上調表達，304個下調表達)[11]；海南細枝木麻黃無性系處理組低溫脅迫中的差異表達基因共有8 585個，其中包括3 872個上調和4 713個下調基因[12]。甘藍型油菜低溫脅迫12 h后誘導表達的差異基因數(shù)量最多，有18 641個，其中8 499個表現(xiàn)上調，10 142個表現(xiàn)下調[13]。低溫脅迫下菊花共有2 310個基因發(fā)生差異表達，其中有1 592個上調基因，718個下調基因，上調基因和下調基因數(shù)量之間無顯著性差異[14]。這些植物均是以下調基因和上調基因協(xié)同表達的模式來同時應答低溫脅迫。上述結果與楊偉等[10]在枇杷幼果低溫脅迫的研究結果也相一致。

對黃獨微型塊莖4℃低溫離體保存中獲得的差異表達基因進行GO的功能分類發(fā)現(xiàn)，部分極其顯著的GO term有液泡繼承、單鏈斷裂修復、紡錘體伸長、麥芽糖分解代謝過程、甘露糖基轉移酶的活性、露糖磷酸轉移酶活性、細胞壁甘露糖蛋白的生物合成過程、G1期細胞有絲分裂周期的早期細胞芽和有絲分裂紡錘體定位的建立等。但郭彤[14]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下菊花差異基因富集相關性由高向低依次為肉桂酸生物合成過程、蛋白發(fā)色基團連接、鹽脅迫反應、L-苯丙氨酸分解代謝過程、高滲反應、光合作用、光捕捉、胞漿轉運、鎘離子反應、光呼吸等。

對黃獨微型塊莖4℃低溫離體保存中獲得的差異表達基因進行KEGG的功能分類發(fā)現(xiàn)，部分極其顯著的pathway有原發(fā)性膽汁酸的生物合成、類固醇激素的合成、氯代環(huán)己烷和氯苯降解、雙酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸軟骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黃素代謝等。值得注意的是，差異表達基因的pathway類中大多開始出現(xiàn)降解的功能亞類，這可能是植物對低溫離體保存的一種應激反應，值得進一步研究。但在西葫蘆[11]、枇杷幼果[10]、番茄[15]、甘藍型油菜[13]和菊花[14]的低溫脅迫中，顯著富集的代謝通路表現(xiàn)不同，分別有6條和5條顯著富集的代謝通路，包括光合作用代謝通路、色氨酸代謝通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路、苯丙素生物合成代謝通路、植物激素信號轉導通路和抗壞血酸代謝通路以及光合作用—天線蛋白、抗壞血酸代謝、植物激素信號轉導、苯基丙氨酸代謝和戊糖與葡萄糖醛酸脂互作代謝等。這表明，在低溫脅迫中，微型塊莖對低溫脅迫的GO功能和代謝通路與植物體應對低溫脅迫的代謝通路顯著不同，究其原因，可能是微型塊莖為薯蕷屬變態(tài)器官所致。

本研究采用illlumina Hiseq2500高通量測序技術對黃獨低溫離體保存微型塊莖的轉錄組進行測序，獲得了大量的高質量數(shù)據(jù)和轉錄本信息，并對處理組的差異表達基因進行了功能注釋、基于各數(shù)據(jù)庫的功能分類富集分析、代謝通路富集分析等，獲得了大量與黃獨微型塊低溫離體保存莖相關的信息，為黃獨微型塊莖的種質保存和后期萌發(fā)提供了理論依據(jù)。

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National Natural Science Foundation of China(31360072)

introduction：HONG Sen-Rong(1974—),male,master,professor,mainly engaging in plant biotechnology.

date:2017-03-21

TranscriptomeAnalysisofDioscoreabulbiferaL.MicrotubersConservedinvitroatLowTemperature

HONG Sen-Rong WU Hui ZHONG Lu XIONG Si-Min LUO Xia LIU Xing

(College of Life Sciences,Shangrao Normal University,Shangrao 334001)

WithDioscoreabulbiferaL. microtubers, we studied the conservationinvitroat 4℃ low temperature and its transcriptome analysis. After the original data were pretreated, the effective ratio of reads in the control group(Con25) and the treatment group(Con4) was 98.67% and 98.69%, respectively. The 219792 transcripts of 200 bp(177Mb) and 161066 Unigenes(99Mb) were obtained after the removal of the splicing sequence; 10 species of the most NR annotations in the Unigene was Aureobasidium pullulans EXF-150, Vitis vinifera, Theobroma cacao, Oryza sativa Japonica Group, Amborella trichopoda, Setaria italica, Aureobasidium pullulans var. namibiae CBS 147.97, Jatropha curcas, Aureobasidium melanogenum CBS 110374 and Pestalotiopsis fici W106-1, respectively. The 5 KOG of the annotated most unigenes were general function prediction only, signal transduction mechanisms, posttranslational modification, protein turnover, chaperones, translation, ribosomal structure and biogenesis and energy production and conversion. The 5 pathway of the KEGG annotated most unigenes were carbon metabolism, biosynthesis of amino acids, glycolysis/gluconeogenesis, starch and sucrose metabolism and pyruvate metabolism. The number of annotated unigenes was 26 006, the number of different annotated enzymes was 1 177, and the number of different pathway was mapped to 327. Gene function of samples in Biological Process classification mainly gathered at cellular process and metabolic process, in Cellular Component classification it gathered at cell and cell part, in Molecular Function classification mainly concentrated in binding and catalytic activity. In conservationinvitroat low temperature ofD.bulbiferaL. microtubers, a total of 164 145 differentially expressed genes was obtained, of which 63305 genes were up-regulated and 100 840 genes were down regulated. Extremely significant GO terms of the differentially expressed genes were vacuole inheritance, single strand break repair, mitotic spindle elongation, maltose catabolic process, mannosyltransferase activity, mannosylphosphate transferase activity, cell wall mannoprotein biosynthetic process, G1 phase of mitotic cell cycle, incipient cellular bud site and establishment of mitotic spindle orientation. Extremely significant pathways of the differentially expressed genes were primary bile acid biosynthesis, steroid hormone biosynthesis, chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation, bisphenol degradation, fluorobenzoate degradation, glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate, glycosaminoglycan biosynthesis-heparan sulfate, toluene degradation, naphthalene degradation and riboflavin metabolism. The experimental results provides a theoretical basis for germplasm conservation ofD.bulbiferaL. microtuber and its subsequent germination.

DioscoreabulbiferaL.;microtuber;conservationinvitroat low temperature;transcriptome analysis

國家自然科學基金項目(31360072)

洪森榮(1974—)，男，碩士，教授，主要從事植物生物技術方面的研究。

2017-03-21

S632.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.012