張 玉 張 悅 張春蕊 王艷敏,2 王玉成 王 超*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081)

剛毛檉柳腺苷甲硫氨酸脫羧酶(ThSAMDC)基因的克隆與脅迫下的表達分析

張 玉1張 悅1張春蕊1王艷敏1,2王玉成1王 超1*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081)

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase,SAMDC)是一種通過參與多胺的代謝途徑來調節(jié)植物生理生化過程的限速酶。通過分析剛毛檉柳(Tamarixhispida)的轉錄組數據，獲得并克隆了SAMDC基因的cDNA序列，將其命名為ThSAMDC。該cDNA序列全長2 085 bp，包含tiny ORF(tORF)、upstream ORF(uORF)和main ORF(mORF)3個植物SAMDC基因特征ORF。主開放讀碼框(mORF)長1 107 bp，編碼369個氨基酸多肽，相對分子質量為40.34 kD，理論等電點(PI)為4.72。ThSAMDC編碼蛋白具有多個較強的親水性區(qū)域，無明顯跨膜區(qū)。通過與其他多個物種的氨基酸多序列比對結果表明，ThSAMDC具有兩個典型的高度保守的結構域：酶原剪切位點(LSESSLF)與蛋白快速降解有關的PEST(TIHVTPEDGFSYAS)結構域。系統發(fā)育樹結果表明ThSAMDC與菠菜(SoSAMDC)氨基酸序列一致性最高，為77%。實時熒光定量RT-PCR分析顯示，ThSAMDC在NaCl、PEG、ABA、CdCl2誘導表達均上調，預示著ThSAMDC可能在剛毛檉柳非生物脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用。

剛毛檉柳；腺苷甲硫氨酸脫羧酶；脅迫響應；基因表達

多胺(polyamines,PAs)是一種廣泛存在于生物細胞中的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，主要包括腐胺(Putrescine，Put)、亞精胺(Spermidine，Spd)和精胺(Spermine，Spm)[1～2]。多胺參與胚胎發(fā)育、細胞分化、形態(tài)發(fā)生等發(fā)育過程[3]，并在植物應答生物脅迫和非生物脅迫過程中起著重要作用[4～9]。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)是多胺合成的一個關鍵酶[10]，主要催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)脫羧基，形成脫羧S-腺苷甲硫氨酸(decarboxy-lated S-adenosylmethionine,dcSAM)，dcSAM為精胺和亞精胺的生物合成提供氨丙基。研究發(fā)現，過量表達SAMDC基因，能夠調節(jié)植物體內多胺積累水平，從而提高植物抗逆能力。Bhavna[11]等將人類SAMDC基因轉入煙草，轉基因煙草植株體內源亞精胺和腐胺含量明顯增高，植物耐鹽性和滲透性顯著提高。Momtaz[12]等通過基因槍遺傳轉化法將從酵母中分離的SAMDC基因導入棉花莖尖，SAMDC基因提高了棉花體內精胺含量，同時轉基因植株的耐旱性也得到顯著增強。Malabika和Ray[13]研究表明，在水稻植株體內過量表達SAMDC基因使多胺含量提高，耐鹽性明顯增強。可見，SAMDC基因在植物抗逆基因工程育種中具有廣闊的應用前景，對其抗逆功能和調控機理的研究具有重要意義。

迄今為止，已經從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、大豆(Lycinemax)[15]、蘋果(Malussylvestris)[16]、葡萄(Vitisvinifera)[17]等多種植物中分離了編碼SAMDC基因，并對其表達活性與植物多胺合成和逆境響應的關系進行了研究，但是SAMDC基因在剛毛檉柳(Tamarixhispida)中的相關研究還未見報道。剛毛檉柳(Tamarixhispida)是一種具有極強抗逆能力和較強生態(tài)適應性的鹽生木本植物，是研究木本植物抗逆機制和篩選及分離抗逆基因的理想材料[18]。為了深入了解SAMDC基因在檉柳非生物脅迫應答中的功能，本研究克隆獲得了一條剛毛檉柳SAMDC基因(ThSAMDC)全長cDNA序列，并用生物信息學對該序列進行了分析，同時利用實時熒光定量RT-PCR技術分析了ThSAMDC在檉柳地上部分和根部分組織中對不同非生物脅迫的響應模式，為該基因的功能鑒定及利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理方法

將檉柳的種子播種于V泥炭土∶V蛭石=3∶2的混合土壤中，放置于光/暗時間為16 h/8 h、光照強度為400 μmol·m-2·s-1溫度(22±2)℃、相對濕度為70%～75%的溫室中培養(yǎng)。待檉柳幼苗生長至2個月左右時，取長勢一致且生長狀態(tài)良好的幼苗，分別用0.4 mol·L-1NaCl、20% PEG6000、150 μmol·L-1CdCl2和100 μmol·L-1ABA溶液進行脅迫處理1、2、6、12、24和48 h，每個時間點都以正常水澆灌的幼苗作為對照，分別取剛毛檉柳的地上部組織和根部組織，每個樣品取15顆幼苗，每個處理重復3次，將其充分混合后放入液氮速凍，置于-80℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 總RNA的提取

采用CTAB法提取對照、0.4 mol·L-1NaCl、20% PEG、100 μmol·L-1ABA和150 μmol·L-1CdCl2處理下各個時間段的剛毛檉柳地上部分和地下組織總的RNA，采用DNaseI(Promega)消除殘存的DNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)說明書進行反轉錄合成cDNA第一條鏈，將合成的cDNA稀釋10倍，用作定量RT-PCR的模板。

1.3 ThSAMDC基因的克隆與序列分析

根據剛毛檉柳轉錄組數據中Unigenes功能注釋結果，查找并獲得一條SAMDC基因的序列。為了驗證基因序列的準確性，根據基因序列設計引物，上游引物序列為ATGACGGTTGGCCCTACAG，下游引物序列為TCAGTCCTTTTCTTCCTCC。將SAMDC基因克隆到pMD18-T載體上并重新測序。

利用在線工具ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定ThSAMDC的開放讀碼框；利用Bioedit軟件進行多序列比對以及同源蛋白序列的分析；利用ExPASy(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預測ThSAMDC的理論等電點、分子式及蛋白質分子量。利用MEGA6.0軟件構建系統進化樹以及進行系統發(fā)育分析；利用在線工具TMpred(http://www.genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測ThSAMDC的跨膜區(qū)；使用Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)在線軟件對ThSAMDC蛋白質的疏水性進行分析。利用在線軟件(https://www.predictprotein.org/)預測該基因編碼的蛋白質的二級結構。利用CELLO2GO軟件(http://cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)預測其亞細胞定位。

1.4 實時定量RT-PCR表達分析

根據ThSAMDC全長cDNA序列設計定量RT-PCR引物，以剛毛檉柳α-tubulin(FJ618518)，β-actin(FJ618517)和β-tubulin(FJ618519)3個基因作為內參基因，引物序列見表1。利用MJ Opticon實時定量PCR儀(Bio-Rad，Hercules，CA)分析ThSAMDC基因的表達模式。采用實時熒光定量RT-PCR反應試劑盒為TransStart Top Green qPCR SuperMix(TransGen)，反應體系：10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，10 μmol·L-1的上游引物和下游引物各1 μL，2 μL稀釋后的cDNA模板，以無菌水補足體積至20 μL。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃讀板1 s，45個循環(huán)。每個樣品重復3次，用2-ΔΔCt方法進行基因的相對定量分析[19～20]。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 ThSAMDC基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過分析與查找剛毛檉柳轉錄組數據，獲得一條SAMDC基因編碼序列，cDNA長度為2 085 bp。為確?；蛐蛄行畔⒌臏蚀_性，根據SAMDC全長序列設計引物并進行基因克隆和測序。PCR擴增獲得到一條長度約2 000 bp的條帶，與預期相符(圖1A)。將PCR產物回收，與pMD18-T載體連接并轉化大腸桿菌。從轉化子中提取質粒DNA進行酶切檢測，結果顯示，酶切產物出現2條預期條帶，外源插入的cDNA片段長度約2 000 bp(圖1B)。將質粒送至上海生工進行測序，測序的結果與轉錄組測序拼接結果完全一致，并將該基因命名為ThSAMDC。ThSAMDC全長2 085 bp，由ORF founder分析確定該基因包含3個植物SAMDC特征ORF(open reading frame，ORF)，分別為9 bp的微型ORF(tiny ORF，tORF)，162 bp的上游ORF(upstream ORF，uORF)和1 107 bp的主ORF(main ORF，mORF)。微型ORF(tORF)僅編碼2個氨基酸，且與上游ORF(uORF)擁有共同堿基A，即uORF起始密碼子ATG第一個堿基A為tORF的終止密碼子最后一位堿基。

圖1 檉柳ThSAMDC基因的克隆 A.檉柳ThSAMDC基因RT-PCR擴增；B.ThSAMD-PMD18-T質粒酶切(SaIⅠ和XbaⅠ)Fig.1 Cloning of ThSAMDC gene from T.hispida A. RT-PCR amplification of ThSAMDC gene; B. ThSAMDC-PMD18-T plasmid digestion(SaIⅠ and XbaⅠ)

ThSAMDCmORF長為1 107 bp，編碼369個氨基酸(圖2)。mORF編碼蛋白質的分子量為40.34 kD，理論等電點(PI)為4.72，推測其分子式為C1795H2775N449O562S22。疏水性分析發(fā)現，ThSAMDC編碼蛋白質在整個肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸且具有明顯的親水區(qū)，雖然C末端有一個較強的疏水區(qū)，但整條肽鏈表現出親水性(圖3)。利用TMpred進行跨膜結構預測，結果表明無跨膜蛋白。利用Predict protein軟件對ThSAMDC編碼蛋白進行二級結構預測分析發(fā)現：蛋白質的二級結構主要由β-折疊和無規(guī)則卷曲構成，其中α-螺旋占18.75%，β-折疊占25.54%，無規(guī)則卷曲占55.71%(圖4)。利用CELLO2GO在線軟件預測ThSAMDC基因編碼蛋白的亞細胞定位，結果顯示ThSAMDC定位于細胞質概率最高，為85.91%，推測其定位于細胞質(表2)。

圖2 ThSAMDC的核酸序列及推演的氨基酸序列 粗線表示tORF；細線表示uORF；細線框表示mORFFig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of ThSAMDC Tiny ORF is showed in thick underline; Up-stream ORF is showed in thin box; Main ORF is showed in thick box

表2 ThSAMDC亞細胞定位

圖3 ThSAMDC蛋白質的疏水結構預測Fig.3 Hydrophobicity analysis of ThSAMDC

2.2 ThSAMDC氨基酸比對與進化樹分析

將ThSAMDC氨基酸序列與8種植物SAMDC蛋白的氨基酸序列進行多重比對分析，結果表明，ThSAMDC與其他植物的SAMDC蛋白氨基酸序列具有較高的一致性，其中與SoSAMDC(菠菜)序列一致性最高為77%。比對的9種植物SAMDC基因編碼蛋白都包含兩個SAMDC蛋白特有的保守結構域：酶原剪切位點結構域LSESSLF(在剛毛檉柳中是76～83位)和與蛋白快速降解有關的PEST(TIHITPEDGFSYAS)結構域(在剛毛檉柳中是254～267位)(圖5)。在氨基酸比對的基礎上，為進一步了解ThSAMDC與其他植物的SAMDC蛋白之間的進化關系，利用MEGA6.0的Neighbor-Joining方法構建系統進化樹，結果顯示：ThSAMDC與BvSAMDC(甜菜)聚為一組(圖6)，表明剛毛檉柳SAMDC與甜菜SAMDC的親緣關系最近。

圖4 ThSAMDC蛋白質二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of ThSAMDC

圖5 剛毛檉柳ThSAMDC與其他植物SAMDC同源序列的比較 細線框.酶原剪切位點結構域(LSESSLF)；粗線框.蛋白快速降解有關的PEST(TIHVTPEDGFSYAS)結構域 圖中從上至下依次代表的是剛毛檉柳、菠菜、棉花、擬南芥、高粱、玉米、大麥、葡萄、大豆、薺菜的SAMDC氨基酸列Fig.5 Comparison of ThSAMDC in Tamarix hispida with other plant SAMDC genes homologous sequences Thin box:enzyme cleavage site domain(LSESSLF); Thick box: rapid degraded Protein PEST(TIHVTPEDGFSYAS) domain The amino acid sequence in the map which from the top to the bottom represent is: Tamarix hispida(U44057),Spinacia olerace(KNA20761.1),Gossypium hirsutum(JN020148.1),Arabidopsis thaliana(NM_113454.3),Sorghum bicolor(XM_002446695.1),Zea(NM_001112243.2),Hordeum vulgare subsp(AK250521.1),Vitis vinifera(AJ567368.2),Glycine max(AF488307.1),Brassica juncea(AF215665.1)

圖6 幾種植物蛋白同源序列的系統進化樹分析 標尺代表每單位氨基酸的變化；0.05代表兩個序列之間5%的差異 SlSAMDC.茄子；NtSAMDC.煙草；CrSAMDC.長春花；ThSAMDC.剛毛檉柳；BvSAMDC.甜菜；VvSAMDC.葡萄；GhSAMDC.棉花；GmSAMDC.大豆；AtSAMDC.擬南芥；BjSAMDC.薺菜；SbSAMDC.高粱；ZeSAMDC.玉米；HvSAMDC.大麥；SoSAMDC.甘蔗Fig.6 Phylogenetic tree analysis of SAMDC proteins from various plant species The scale bar expected number of substitutions per site;0.05 means 5% changes were observed between two sequences SlSAMDC.Solanum lycopersicum(EF550528.1); NtSAMDC.Nicotiana tabacum(AF033100.1); CrSAMDC.Catharanthus roseus(U12573.1); BvSAMDC.Beta vulgaris subsp(XP_010681339.2); VvSAMDC.Vitis vinifera(AJ567368.2); GhSAMDC.Gossypium hirsutum(JN020148.1); GmSAMDC.Glycine max(AF488307.1); AtSAMDC.Arabidopsis thaliana(NM_113454.3); BjSAMDC.Brassica juncea(AF215665.1); SbSAMDC.Sorghum bicolor(XM_002446695.1); ZeSAMDC.Zea(NM_001112243.2); HvSAMDC.Hordeum vulgare subsp(AK250521.1); SoSAMDC.Saccharum officinarum(GQ246459.1)

圖7 ThSAMDC基因在不同脅迫下的表達模式分析基因相對表達量經過Log2轉換，>0代表上調表達；=代表表達無變化；<0代表下調表達。Fig.7 Expression analysis of ThSAMDC gene under different abiotic stresses Relative expression level was Log2 transformed; >0,upregulation; =0,no change in regulation; <0,downregulation.

2.3 ThSAMDC基因在脅迫條件下的表達分析

為深入探究檉柳ThSAMDC基因在逆境脅迫條件下的相對表達量變化，我們利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因分別在0.4 mol·L-1NaCl、20% PEG和150 μmol·L-1CdCl2脅迫和、100 μmol·L-1外源ABA處理下的表達模式。如圖7所示，無論在地上部分還是在根部組織中，ThSAMDC的表達都受到NaCl、PEG、CdCl2和外源ABA的誘導，但在不同處理下的表達模式有所差異。

在NaCl處理條件下，ThSAMDC基因在檉柳地上和根部組織中的相對表達量顯著上升，且在脅迫24 h后達到峰值，分別是對照條件下的8.15和5.11倍。

在PEG處理條件下，ThSAMDC基因在檉柳地上和根部組織中都受到誘導表達。其中在根部組織中，ThSAMDC的相對表達量具有雙峰型特征，分別在脅迫1和48 h其相對表達量達到峰值。ThSAMDC基因在地上部組織中與在根部組織中的表達具有相似性，在脅迫1 h后表達量達到最高水平，之后逐漸下降，在12 h后又有所回升。此外，與地上部分相比，ThSAMDC表達在根部組織中受誘導程度更高。

在外源ABA處理條件下，ThSAMDC的表達在檉柳地上部分和根部組織中也受到不同程度的誘導。其中在地上部組織中，ThSAMDC相對表達量同樣具有雙峰特征，在ABA處理1 h后和48 h達到峰值。ThSAMDC的表達在根部組織中也受到了ABA的誘導，與地上部分相比，在各時間點表達變化較平穩(wěn)，表達量在對照的2～5倍。

在CdCl2的脅迫下，ThSAMDC的表達也受到強烈誘導。在地上部組織中，ThSAMDC的相對表達量在脅迫1 h時達到峰值，脅迫24 h后，相對表達量緩慢上升，之后降低。ThSAMDC在根部組織中的相對表達量變化較不穩(wěn)定，脅迫后其相對表達量逐漸上升，而在脅迫2 h后下降，在12 h降到低谷，隨后其相對表達量急劇上升，并在48 h達到峰值。

上述實驗結果表明，ThSAMDC基因的表達可受NaCl、PEG、ABA和CdCl2等外界非生物脅迫條件的誘導，推測該基因可能參與植物非生物逆境脅迫的響應過程。同時，我們也發(fā)現，在不同組織中ThSAMDC的表達受脅迫誘導程度存在差異。NaCl脅迫下，ThSAMDC表達在地上部分受誘導程度略高于根部組織，而在PEG脅迫下，在根部組織中受誘導程度明顯高于地上部組織；CdCl2脅迫下，ThSAMDC在根組織中受誘導程度略高，而在ABA處理下則表現為在地上部組織中受誘導程度更高。在脅迫條件下，ThSAMDC的表達具有一定的組織特異性，表明在檉柳響應非生物脅迫過程中，ThSAMDC在不同組織中存在不同的表達調控機制。

3 討論

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)在植物多胺的生物合成過程中具有重要的作用。目前，已在多種植物中發(fā)現并分離了編碼S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的基因，并發(fā)現不同植物中SAMDC具有很高的序列相似性[21]。植物SAMDC基因在主要開放閱讀框(main-ORF)內沒有內含子,而5′-UTR中還含有2個ORF，分別是tORF和uORF，并且這2個ORF有1個堿基的重疊，這種重疊結構對于基因表達的影響目前尚不清楚。大多數植物的SAMDC基因uORF編碼49～54個氨基酸殘基，氨基酸序列十分保守，同源性在75%～100%[22]。植物中SAMDC上游uORF在轉錄或轉錄后水平調控基因表達中起關鍵作用[23]。去除SAMDC基因上游uORF將導致植物中該酶的翻譯效率提高，破壞體內多胺含量的動態(tài)平衡，影響植物的生長發(fā)育[24]。本研究克隆的ThSAMDC全長2 085 bp，mORF長為1 107 bp，編碼369個氨基酸。5′-UTR長162 bp，與其它植物SAMDC基因一樣，5′-UTR內具有tORF和uORF，且tORF和uORF有一個堿基重疊，uORF編碼54個氨基酸，可能參與ThSAMDC轉錄和轉錄后調控，對維持檉柳體內多胺的動態(tài)平衡具有重要的功能。

多胺不僅是植物體內的一種生長調節(jié)物質，同時作為一種滲透調節(jié)物質在植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮作用[4,25]。作為多胺合成途徑中的關鍵基因，SAMDC基因通過調控多胺含量來調節(jié)植物的抗逆性。SAMDC基因在水稻幼苗中的表達受鹽、干旱和ABA的誘導[26]；轉入SAMDC基因使水稻體內亞精胺、精胺含量提高3～4倍，促進了幼苗在鹽脅迫下的生長[27]；過表達康乃馨SAMDC基因的轉基因煙草體內多胺含量增加，抗氧化酶類基因轉錄水平提高，進而增強了轉基因植株抵御鹽、冷和ABA等非生物脅迫的能力[28]。這些研究已證實在植物中過量表達SAMDC基因可提高轉基因植物的抗旱耐鹽能力，表明該基因在植物的抗逆基因工程育種方面具有重要價值。為了研究SAMDC基因在檉柳非生物脅迫應答中的功能，本研究利用定量PCR技術分析了剛毛檉柳在NaCl、PEG、CdCl2和外源ABA處理下ThSAMDC的表達情況，結果顯示，ThSAMDC基因的表達受NaCl、PEG和CdCl2的誘導，推測ThSAMDC基因在檉柳抵御高鹽、干旱和重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。同時，ThSAMDC表達還受到外源ABA的誘導，表明ThSAMDC依賴于ABA信號途徑參與和調節(jié)檉柳的非生物脅迫應答。盡管ThSAMDC的表達能夠受到高鹽、干旱和重金屬脅迫的誘導，但其在不同脅迫下的表達模式存在明顯差異，這表明ThSAMDC對不同非生物脅迫的響應機制并不相同，其具體的生物學功能和作用機制需要進一步的研究。

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National Natural Science Foundation of Heilongjiang Province(QC2016019)；Fundamental Research Funds for the Central Universities(2572014CA12)

introduction：ZHANG Yu(1991—),female,Mainly engaged in forestry research of stress resistance.

date:2017-07-04

CloningandExpressionAnalysisofS-AdenosineMethionineDecarboxylase(ThSAMDC)GenefromTamarixramosissima

ZHANG Yu1ZHANG Yue1ZHANG Chun-Rui1WANG Yan-Min1,2WANG Yu-Cheng1WANG Chao1*

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040；2.Forestry Science Reseach Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150081)

S-adenosyl-L-methionine decarboxylase(SAMDC) is a rate-limiting enzyme that regulates the physiological and biochemical processes of plants by participating in the metabolic pathway of polyamines. The cDNA of S-Adenosine Methionine Decarboxylase gene(namedThSAMDC) was isolated and cloned by analyzing the transcriptome data ofTamarixhispida. The full-length ofThSAMDCis 2 085 bp, with three open reading frames, tiny ORF(tORF), upstream ORF(uORF) and main ORF(mORF). The mORF was 1 107 bp encoding 369 amino acids. The relative molecular weight and isoelectric points(PI) of the putative protein were 40.34 kD and 4.72.ThSAMDC-encoded protein has a number of strong hydrophilic regions, no obvious transmembrane region. Compared to the amino acid multiple sequence alignment of several other species, ThSAMDC includes two highly conserved domains: the proenzyme cleavage site(LSESSLF) and the PEST domain(TIHVTPEDGFSYAS) associated with the rapid degradation of the protein. Phylogenetic tree analysis shows thatThSAMDChas higher sequence similarity of 77% identities to theSpinach(SoSAMDC). Quantitative real-time PCR assay revealed that the mRNA level ofThSAMDCwas significantly up-regulated under NaCl, PEG, ABA and CdCl2treatments inT.hispida, suggesting thatThSAMDCmay play an important role in drought resistance, salt tolerance and other stresses.

Tamarixhispida；S-adenosylmethionine decarboxylase；stress responses；gene expression

黑龍江省科學基金項目(QC2016019)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(2572014CA12)

張玉(1991—)，女，碩士研究生，主要從事林木抗逆機理方面研究。

* 通信作者：E-mail:wzyrgm@163.com

2017-07-04

* Corresponding author：E-mail:wzyrgm@163.com

S793.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.016

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