袁德成 趙寒梅 楊逢建

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

塔拉種子多糖脫蛋白的正交優(yōu)化及其抗氧化性研究

袁德成 趙寒梅 楊逢建*

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

以塔拉(Caesalpiniaspinosa)種子為原料，研究了塔拉種子多糖的脫蛋白工藝及塔拉多糖的抗氧化性質(zhì)。以多糖損失率和蛋白脫除率為評價指標，比較Sevage法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法對塔拉多糖的脫蛋白效果。利用正交優(yōu)化組合實驗設計原理，采用四因素三水平的正交分析法，對木瓜蛋白酶法脫蛋白進行正交優(yōu)化。結(jié)果表明：塔拉多糖最佳脫蛋白工藝條件為酶添加量0.15 mL、酶解時間90 min、酶解溫度60℃、酶解pH=6，蛋白脫除率95.19%，多糖保留率75.02%。通過對塔拉多糖抗氧化性的研究，發(fā)現(xiàn)塔拉多糖總抗氧化性較好，對DPPH自由基有較強的清除作用。

塔拉多糖；脫蛋白；正交優(yōu)化；抗氧化性

塔拉(Caesalpiniaspinosa)又名刺云實，屬于豆科(Leguminosae)植物，該植物原產(chǎn)南美洲，主要產(chǎn)地為秘魯、智利、厄瓜多爾等國，我國在“九五”期間從南美引進了替代五倍子生產(chǎn)沒食子單寧及其系列產(chǎn)品的補充原料植物——塔拉，并已經(jīng)在云南引種成功[1]。塔拉的種子即為塔拉豆，塔拉豆的胚乳含量為30.5%，胚乳中的聚糖含量大于78%[2]，主要作為乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、改性劑及醫(yī)藥佐劑，可廣泛用于紡織、醫(yī)藥、石油，尤其是食品工業(yè)中[3]，具有重大的經(jīng)濟效益。

針對塔拉多糖的研究領域，至今相關的研究文獻較少，塔拉多糖的純化是對其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)研究的基礎步驟，本文是以不同方法對塔拉種子脫蛋白，正交優(yōu)化其工藝條件，并且對塔拉多糖的抗氧化性進行研究，以期為塔拉多糖的拓展研究提供更多、更有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

材料及試劑：塔拉豆，石油醚(60～90)、無水乙醇、葡萄糖標準品、苯酚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、氯化鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、三氯乙酸、木瓜蛋白酶、DPPH、蒸餾水等均為分析純。

儀器：JP-100ST臺式數(shù)控超聲波、752N型紫外可見分光光度計。

1.2 塔拉粗多糖的提取

1.2.1 塔拉種子的預處理

塔拉種子經(jīng)55℃烘箱烘干48 h，粉碎過40目篩，再55℃烘干48 h，以1∶14的比例經(jīng)石油醚(60～90)脫脂，連續(xù)3次，每次24 h，讓脫脂的塔拉粉末自然干燥，然后置于55℃烘箱中備用。

1.2.2 超聲輔助提取塔拉粗多糖

準確稱取塔拉粉末1.0 g，置于50 mL具蓋離心管中，進行超聲輔助提取[4～5]。在不同提取功率、提取溫度、提取時間、料液比的條件下進行實驗，提取完成后在5 000 r·min-1的高速離心機中離心10 min，取上清，以4倍體積的無水乙醇醇沉24 h，再5 000 r·min-1，離心5 min，取上清，棄沉淀，用苯酚—硫酸法測定粗多糖得率，選擇得率較高的3個水平進行優(yōu)化實驗。

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析得出，塔拉多糖最佳提取條件為超聲功率363.94 W、超聲溫度56.27℃、超聲時間23.26 min、料液比1∶16.93，多糖的率的預測值為25.71%，考慮到實際操作會出現(xiàn)誤差影響,確定塔拉多糖的超聲提取條件為超聲功率363 W、超聲溫度56℃、超聲時間23 min、料液比1∶17，結(jié)果塔拉多糖的得率為25.56%。

1.2.3 繪制葡萄糖標準曲線

準確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補至2 mL，然后再加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL。搖勻，沸水浴加熱20 min后，在冷水中冷卻至室溫。在490 nm波長處測吸光度。同時用2.0 mL蒸餾水做空白對照。得標準曲線方程：Y=14.986X-0.280 31，R2=0.994。

采用苯酚—硫酸法[6～7]，用紫外分光光度計測定吸光度，通過所得葡萄糖標準曲線[8～9]計算出多糖的含量，根據(jù)下式計算多糖得率：

多糖得率%=比色皿測定濃度×樣品稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積/試驗樣品質(zhì)量×100

(1)

實驗樣品質(zhì)量式中：比色皿測定的多糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；樣品溶液稀釋倍數(shù)為125；樣品溶液體積為25 mL；實驗樣品質(zhì)量為4.0 g。

1.2.4 多糖提取率

以多糖提取率為指標，用葡萄糖作為標準物，采用苯酚—硫酸法，在490 nm處測吸光度，得回歸方程Y=14.986X-0.280 31，R2=0.994，通過回歸方程及測得的吸光度計算多糖得率。

1.3 塔拉粗多糖脫蛋白

1.3.1 繪制蛋白質(zhì)標準曲線

采用Bradford報道的考馬斯亮藍G250染色法對塔拉多糖樣品中的蛋白質(zhì)含量進行測定。其原理是蛋白質(zhì)與染料結(jié)合，在590 nm處生成藍色復合物，并且顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度存在一定關系。

準確稱取100 mg考馬斯亮藍G250，將其溶解于50 mL濃度為95%的乙醇中，之后加入100 mL濃度為85%的磷酸溶液，最后用蒸餾水定容在1 000 mL容量瓶中。用濃度為0.15 mol·L-1的氯化鈉溶液配制成0.1 mg·mL-1的牛血清白蛋白溶液。

取6支試管，分別加入牛血清白蛋白標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL(編號0、1、2、3、4、5、6)，各管用氯化鈉溶液補齊至1 mL。分別加入考馬斯亮藍G250溶液1 mL，充分混合，1 h內(nèi)以0號試管為空白對照，使用紫外可見分光光度計在波長為590 nm處，測定相應的吸光度值，并繪制牛血清白蛋白標準曲線(牛血清白蛋白的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標)[10～11]。取塔拉多糖水溶液1 mL，加入考馬斯亮藍G-250溶液1 mL，混勻，1 h內(nèi)用紫外可見分光光度計測定595 nm處的吸光度值，利用牛血清白蛋白標準曲線，計算出多糖樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.2 脫蛋白率

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量，在595 nm處以牛血清蛋白為標準品測吸光度，得回歸方程Y=0.102X+0.143，R2=0.993，通過回歸方程及測得的吸光度計算蛋白含量。

脫蛋白率=脫蛋白前蛋白含量—脫蛋白后蛋白含量脫蛋白前蛋白含量×100%

(2)

多糖保留率=脫蛋白后多糖含量脫蛋白前多糖×100%

(3)

1.4 Sevage法脫蛋白

配置多糖溶液濃度為1 mg·mL-1,用氯仿和正丁醇以體積比4∶1配置Sevag試劑。

取多糖溶液10 mL加入分液漏斗中，加入1/4體積的Sevag試劑，振搖10 s，靜置6 min，除去有機層及蛋白層，5 000 r·min-1離心10 min，取上清測定蛋白質(zhì)及多糖含量。

1.5 三氯乙酸法脫蛋白

配置多糖溶液濃度為1 mg·mL-1，取多糖溶液10 mL置于50 mL具蓋離心管中，分別加入5個不同梯度20%的三氯乙酸，靜置過夜，5 000 r·min-1離心10 min，取上清測定吸光度并計算蛋白質(zhì)及多糖含量。

1.6 木瓜蛋白酶法脫蛋白

配制多糖溶液濃度為5 mg·mL-1，木瓜蛋白酶濃度為10 mg·mL-1，0.1 mol·L-1的NAOH，0.1 mol·L-1的HCl。

取多糖溶液10 mL，在不同酶添加量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH條件下進行反應[12]。在進行酶添加量、酶解時間、酶解溫度的單因素反應時用0.1 mol·L-1的NAOH或者0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH值為6，反應前應37℃的水浴預熱10 min，反應后需在沸水浴中滅酶10 min，然后5 000 r·min-1離心10 min。取上清液測定吸光值并計算蛋白質(zhì)及多糖含量。

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取酶添加量0.15、0.20、0.25 mL；酶解時間60、90、120 min；酶解溫度50℃、60℃、70℃；酶解pH5、6、7；四因素中的3個較高水平進行正交優(yōu)化實驗，根據(jù)測定結(jié)果進行橫向?qū)Ρ?，選出最優(yōu)條件。

1.7 正交優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取酶添加量0.15、0.20、0.25 mL；酶解時間60、90、120 min；酶解溫度50℃、60℃、70℃；酶解pH5、6、7；四因素中的3個較高水平進行正交優(yōu)化實驗，根據(jù)測定結(jié)果進行橫向?qū)Ρ?，選出最優(yōu)條件[13]。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

1.8 塔拉多糖清除DPPH自由基

取0.001 95 g DPPH溶于100 mL無水乙醇，配成DPPH·溶液，備用。

取2 mL DPPH·溶液和2 mL無水乙醇混合均勻，室溫下反應30 min，在5 000 r·min-1的離心機上離心5 min，取上清部分，在517 nm處測吸光值A0；取2 mL DPPH·溶液和2 mL樣品溶液混合均勻，室溫下反應30 min，在5 000 r·min-1的離心機上離心5 min，取上清部分，在517 nm處測吸光值A1；取2 mL無水乙醇和2 mL樣品溶液混合均勻，室溫下反應30 min，在5 000 r·min-1的離心機上離心5 min，取上清部分，在517 nm處測吸光值A2。

多糖樣品的質(zhì)量濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1。

Y(%)=[A0-A1+A2/A0]×100%

(4)

50%抑制濃度IC50可通過自由基清除活性—樣品濃度的線性關系求出。

2 試驗方法及步驟

2.1 Sevag法脫蛋白

Sevag法脫蛋白次數(shù)對蛋白脫除率及多糖保留率的影響。

圖1 Sevag法脫蛋白結(jié)果Fig.1 The results of Sevag method

由圖1可知，用Sevag法脫蛋白時[14～15]，隨著重復次數(shù)的增加，蛋白脫除率也隨之增大，當用Sevage試劑脫蛋白達到第5次時，蛋白脫除率達到最大值。但是多糖的保留率卻逐漸降低，由于Sevage試劑在去除游離蛋白時，使少量多糖隨著蛋白沉淀了。綜合兩者從圖1得出，Sevage法脫蛋白次數(shù)為第5次時，蛋白脫除率為81.63%，多糖保有率為63.06%。此時脫蛋白效果最佳。

2.2 三氯乙酸法脫蛋白

三氯乙酸法脫蛋白的三氯乙酸用量對蛋白脫除率及多糖保留率的影響。

圖2 三氯乙酸法脫蛋白結(jié)果Fig.2 The results of removing protein of three chloroacetic acid method

如圖2所示，隨著三氯乙酸用量的增加[16～17]，蛋白脫除率逐漸增加，當三氯乙酸用量達到2.5 mL時，蛋白脫除率達最大值。對多糖保留率而言，隨著三氯乙酸用量的增加，呈現(xiàn)下降趨勢。因為三氯乙酸與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀時會吸附一定量的多糖，導致多糖含量下降。綜合兩者結(jié)果(圖2)得出，三氯乙酸用量為2.5 mL時，蛋白質(zhì)脫除率為89.16%，多糖保留率為71.5%，此時脫蛋白效果最佳。

2.3 正交優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH值(D)4個因素的水平做L9(34)正交試驗(表2)。

表2 正交實驗設計與結(jié)果

對木瓜蛋白酶脫蛋白的正交實驗結(jié)果(表2)進行極差和方差分析，根據(jù)表2中的均值可以發(fā)現(xiàn)，影響木瓜蛋白酶脫蛋白率的因素主要次序為C-酶解溫度>A-酶添加量>D-酶解ph>B-酶解時間，而影響多糖保留率的因素主要次序為B-酶解時間>A-酶添加量>D-酶解ph>C-酶解溫度，根據(jù)多糖脫蛋白率和多糖保留率率計算綜合評分，并根據(jù)綜合評分選擇最佳的塔拉多糖脫蛋白的工藝條件為A1B2C2D2，即酶添加量0.15 mg、酶解時間120 min、酶解溫度為60℃、酶解pH為6，此時多糖保留率為75.02%，蛋白脫除率為95.15%，綜合評分85.09%。

2.4 最佳工藝條件的驗證實驗

為了檢驗試驗結(jié)果可靠性，通過對正交優(yōu)化數(shù)據(jù)的分析與選取的四個單因素實驗進行綜合對比分析，對正交優(yōu)化所得脫蛋白最佳工藝條件及多糖保留的最優(yōu)條件進行方差分析，得出并確定木瓜蛋白酶脫蛋白的最佳脫除率為95.15%，與此同時木瓜蛋白酶脫蛋白的最佳工藝參數(shù)為：酶添加量0.15 mL、酶解時間90 min、酶解溫度60℃、酶解pH=6，蛋白脫除率95.19%，多糖保留率75.02%。以優(yōu)化得到的實驗條件進行重復實驗，所得真實值與正交優(yōu)化方差分析所得的蛋白脫除率相差很小，為優(yōu)化塔拉多糖脫蛋白工藝提供了可靠的理論依據(jù)。

2.5 塔拉多糖對DPPH自由基的清除作用

由圖3可以看出，塔拉多糖對DPPH自由基清除率與VC對DPPH自由基清除率對照，可以看出該多糖對DPPH自由基有較強的清除能力，并且可以看出提純后的多糖比提純前的多糖對DPPH自由基的清除率高，當多糖質(zhì)量濃0.125 mg·mL-1時，未提取的多糖對DPPH自由基的清除率為14.78%，提純后的為21.77%，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基的清除作用增加，當多糖質(zhì)量濃度在0.125～1 mg·mL-1時，呈現(xiàn)出明顯的劑量效[18～19]，當多糖質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時，提純的多糖對DPPH自由基的清除率達到92.99%，未提純的為77.42%，從分析可得，塔拉多糖對DPPH自由基清除能力IC503.25 mg·mL-1。由此可見，塔拉多糖可以做抗氧化劑，且對DPPH自由基的清除作用相當顯著。并且經(jīng)提純的塔拉多糖較未提純的塔拉多糖抗氧化強。

圖3 不同純度塔拉多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of different purity of Tara polysaccharide on DPPH free radical

3 討論

本實驗通過不同的操作方法對塔拉多糖進行脫蛋白純化。最終所得多糖純度為17.82%。結(jié)果表明，Sevag法和三氯乙酸法對于塔拉多糖的脫蛋白效果都不是很理想，而且造成的多糖損失率也較高，采用木瓜蛋白酶法脫蛋白得到了較好的效果，蛋白脫除率達到了95.19%，且多糖保留率也較高。因此塔拉多糖脫蛋白的最佳方法是木瓜蛋白酶法，這種方法不使用有機溶劑，不會產(chǎn)生新的雜質(zhì)，對塔拉多糖的破壞較小。通過正交實驗得到最佳的木瓜蛋白酶法脫蛋白的條件是酶添加量0.15 mL、酶解時間90 min、酶解溫度60℃、酶解pH=6，蛋白脫除率95.19%，多糖保留率75.02%。

對塔拉多糖的自由基清除能力實驗表明，塔拉多糖是一種天然的具有抗氧化活性的物質(zhì)，具有較強的DPPH清除自由基的能力，并且提純的塔拉多糖的抗氧化能力較未提純的塔拉多糖抗氧化強，是很好的抗氧化物質(zhì)。

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Forestry Public Welfare Industry Research Special(201404616)

introduction：YUAN De-Cheng(1993—)，male，master，Study on plant resources.

date:2017-04-05

StudyonOrthogonalOptimizationandAntioxidationofPolysaccharidefromTaraSeeds

YUAN De-Cheng ZHAO Han-Mei YANG Feng-Jian*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Tara seed as raw material, process and antioxidant properties of protein and polysaccharide of Tara seed polysaccharide of Tara.Using the loss rate of polysaccharide and protein removal rate as the evaluation index to compare Sevage method, three trichloroacetic acid method and papain method of Tara polysaccharide deproteinization effect. Removing protein were optimized by using orthogonal optimization experimental design principle and the method of orthogonal analysis of four factors and three levels of papain method. The results showed that: Tara polysaccharide best protein removal technology for enzyme dosage 0.15 mL, hydrolysis time 90 min, enzymolysis temperature of 60℃, enzymolysis pH=6, protein removal rate was 95.19%, rate of polysaccharide is 75.02%. Through the study of Tara polysaccharide antioxidation of polysaccharide retention at Tara, it is showed thatthe total antioxidant activity of sugar was better, which had a strong scavenging effect on DPPH free radical.

Tara polysaccharide；removing protein；orthogonal optimization；antioxidant activity

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404616)

袁德成(1993—)，男，碩士研究生，主要從事植物資源學的研究。

* 通信作者：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

2017-04-05

* Corresponding author：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

Q949.751.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.019