趙湘培 陳少鋒* 余勝民 鐘 鳴

(1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530012)

實驗研究

瑤藥白花丹炮制前后白花丹醌含量測定及小鼠急性毒性試驗△

趙湘培1陳少鋒1*余勝民1鐘 鳴2

(1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530012)

目的：比較白花丹生品及炮制品的白花丹醌含量及急性毒性大小，為探討白花丹炮制機理提供依據(jù)。方法采用測定半數(shù)致死量的方法對白花丹生品及炮制品的急性毒性進行研究；采用高效液相色譜法測定白花丹生品及炮制品中的白花丹醌的含量。結(jié)果白花丹生品及炮制品的LD50分別為88.7 g/kg、99.5 g/kg，其白花丹醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0136%、0.0041%。結(jié)論白花丹炮制后急性毒性顯著降低，表明用炮制能減少白花丹醌的含量，降低白花丹的毒性。

白花丹；炮制；白花丹醌；急性毒性

白花丹，瑤族民間稱之為“猛老虎”(mongv ndormh maauh，蒙冬卯)或“三錢三”，是瑤醫(yī)常用特色藥材，為白花丹科植物白花丹Plumbago zeylanica L.的干燥全草，主要用于治療風(fēng)濕骨痛、骨質(zhì)增生、跌打損傷、肝硬化和肝脾腫大。具有散瘀消腫，祛風(fēng)除濕，消炎止痛和殺蟲解毒作用[1]。文獻(xiàn)及臨床應(yīng)用表明白花丹藥材有毒，其中毒癥狀為：皮膚與其液接觸引起紅腫，脫皮，誤食后會出現(xiàn)麻痹，孕婦誤食會引起流產(chǎn)；家畜誤食會引起瀉下[2]。白花丹醌是白花丹的主要成分，具有抗菌、抗癌等活性，該成分在體內(nèi)外均有毒性[3-4]。白花丹的毒性，始終是制約其藥效的一個因素。酒制法“通血脈”、“祛風(fēng)”、“殺腥”，“酒制升提，引藥上行”多用于活血化瘀藥、祛風(fēng)通絡(luò)和苦寒類藥物[5]，為此，本課題組對白花丹的炮制工藝進行了優(yōu)選，分別測定了生品及炮制品中白花丹醌的含量，同時對2種樣品進行了小鼠急性毒性試驗，為白花丹的急性毒性評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材：白花丹藥材，采自廣西金秀縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為白花丹科植物白花丹(Plumbago zeylanica L.)，烘干切片。

1.2 主要試劑與器材：白花丹醌對照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，YDM7869，純度>98%)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為化學(xué)純。

1.3 實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，體重18～22g，雌雄各半。購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SXK桂2003-0003。動物購回后，雌雄分飼，由專人飼養(yǎng)管理，動物室溫度控制在18～25℃，相對濕度控制在50%～60%，動物室按常規(guī)定期消毒。

2 方法

2.1 藥學(xué)研究

2.1.1 白花丹炮制品的制備：取白花丹生品藥材1000 g，黃酒200 mL，邊加藥材邊均勻噴灑黃酒(用噴霧瓶均勻噴灑)，文火翻炒，炒至藥材微黃，關(guān)火，放涼，篩除雜質(zhì)，剩余的藥材存儲備用[6]。

2.1.2 白花丹生品與炮制品中白花丹醌的薄層色譜分析：供試品溶液的制備：分別取白花丹生品、炮制品藥材粉末約1 g(60目篩)，加甲醇15 mL置錐形瓶中，密塞，超聲處理30 min，濾過，濾液加15mL石油醚萃取，取石油醚層蒸干，加甲醇1 mL溶解作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：取白花丹醌對照品10 mg，甲醇溶解，配制成0.1mg/mL的溶液作為對照品溶液。

展開系統(tǒng)：分別吸取白花丹生品及炮制品供試品溶液及白花丹醌對照品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-丙酮(9:2)為展開劑，展開，取出，晾干，日光檢視。

2.1.3 白花丹生品與炮制品中白花丹醌的含量測定[6-8]：色譜條件確定：經(jīng)實驗摸索，通過紫外掃描確定白花丹醌的最大吸收波長為260 nm，以白花丹醌保留時間、峰形、分離度為考察指標(biāo)，確定以下色譜條件：diamonsil-2 C18色譜柱：(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0-25 min，30%→65%A)，柱溫25℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長260 nm，檢測靈敏度1 AUFS。

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：精密稱取白花丹醌標(biāo)準(zhǔn)品9.25 mg，用甲醇定容至100 mL，即配制成0.0925 mg/mL的溶液，并儲存在冰箱中。

2.1.3.2 供試品制備：所有白花丹樣品都研磨成粉末，過60目篩，精密稱取白花丹生品及炮制品藥材粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.1.3.3 線性關(guān)系的考察：取對照品溶液，分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，按3.3項下色譜條件進行測定，流速：0.8 mL·min-1，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行回歸，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.1.3.4 精密度試驗：精密吸取白花丹炮制品溶液，按3.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，每次10 μL，測定峰面積。

2.1.3.5 重復(fù)性考察：稱取同一批白花丹炮制品品粉末適量，共6份，分別按“供試品制備”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定RSD值。

2.1.3.6 回收率試驗：精密稱取已知含量的同一產(chǎn)地白花丹樣品粉末適量，共6份，每份2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加含白花丹醌0.0925 mg/mL的對照品甲醇溶液3 mL，再精密加甲醇22 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率。

2.1.3.7 穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，按2.3項下色譜條件，分別于，于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，按上述色譜條件進樣測定RSD值。

2.1.4 樣品含量測定結(jié)果：精密稱取各批樣品適量，分別按“2.3”項下方法制備供試樣品溶液，按2.3項下色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品中白花丹醌的含量。

2.2 小鼠急性毒性試驗:采用半數(shù)致死量法。將白花丹生品及炮制品分別 粉碎為粗粉，加水浸泡2 h，以武火煮沸后改文火煎煮30 min，冷卻30 min后濾渣取汁。將濾渣再煎煮2次取汁。將藥汁混合，濃縮制得每毫升含生藥2.5 g的白花丹生品及炮制品水煎液，置冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)計白花丹生品和炮制品的染毒劑量。每種樣品設(shè)5個劑量，其中白花丹生品為70.8、78.7、87.6、97.2、114.4 g/kg；白花丹炮制品為70.8、78.7、87.6、97.2、114.4 g/kg。選用18～22 g的昆明種小鼠，每組10只，雌雄各半，于灌胃前禁食12 h。各組按相應(yīng)劑量一次性灌胃給藥40 mL/kg體質(zhì)量，對照組給予等容積的蒸餾水。嚴(yán)密觀察并記錄給藥后4 h內(nèi)動物的反應(yīng)情況，并連續(xù)觀察2 W內(nèi)動物的異常反應(yīng)及死亡情況。同時，將死亡動物及時進行解剖，肉眼觀察主要臟器有無明顯病理改變，未死亡動物于2 W后處死，進行尸檢，觀察主要臟器有無病理改變。

根據(jù)改良寇氏法公式計算半數(shù)致死量(LD50)：LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]；LD50的95%可信限= lg-1(LD50±1.96×Sx50)；Sx50=i ∑pq/n。式中：Xm=最大劑量組劑量的對數(shù)值；i=劑間比的對數(shù)值；∑p=各組死亡率之和；p=各組死亡率；q=各組存活率；q=1-p；n=各組動物數(shù)；Sx50=logLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

3 結(jié)果

3.1 白花丹醌的薄層色譜分析：供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點。見圖1。

圖1 白花丹及其炮制品TLC圖譜

3.2 白花丹醌含量測定結(jié)果：對白花丹醌含量測定方法學(xué)的考察結(jié)果顯示：線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=139.93X+19.04 (R2=0.9999)進樣量線性范圍為0.0231～0.2310 μg，定量限(LOQ)=5 ng/mL，檢出限(LOD)=1 ng/mL。表明白花丹醌對照品進樣量在0.0231～0.2310 μg之間時，進樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。精密度試驗結(jié)果表面白花丹醌的RSD為0.37%(n均為6)，表明儀器精密度良好。重復(fù)性考察按本次色譜條件進樣測定，RSD值為1.64%，表明本方法重復(fù)性好。白花丹醌的加樣回收率為92.80%，RSD=0.33% (n=6)。穩(wěn)定性試驗中白花丹醌的RSD值為0.64%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。白花丹生品、炮制品中白花丹醌含量分別為0.0136%、0.0041%。炮制后，其含量約為生品的三分之一。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

圖2 白花丹醌含量測定

3.3 小鼠急性毒性實驗結(jié)果：在灌胃給予白花丹生品及炮制品后，部分動物3～5 min后相繼出現(xiàn)異常興奮，間歇性抽搐，四肢及尾部顏色發(fā)青，部分動物嚴(yán)重驚厥死亡。給藥10 min左右，陸續(xù)有動物死亡，極個別動物2d死亡。大部分小鼠死亡時，面部、尾發(fā)黑。其胃及小腸內(nèi)含有與樣品性狀相同的物質(zhì)，其心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺等重要臟器也未見明顯異常。14d后，處死存活動物，解剖觀察各臟器，均未見明顯異常。

表2 白花丹生品對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果

表3 白花丹炮制品對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果

表4 白花丹生品及炮制品的LD50及95%可信限(g/kg)

由上述表格可以看出，白花丹炮制品組小鼠死亡數(shù)量、死亡時間較生品組有所減少并延后，炮制品LD50低于生品，提示黃酒炮制能降低白花丹毒性。

4 討論

瑤族醫(yī)藥是祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，應(yīng)用歷史悠久。在漫長的醫(yī)療實踐中，瑤醫(yī)根據(jù)藥物的形態(tài)、性味功能及臨床應(yīng)用特點將傳統(tǒng)常用藥物歸納為“五虎、五牛、十八鉆、七十二風(fēng)”，在民間流傳[9]?，庒t(yī)認(rèn)為“虎”類藥物性能峻猛,見效快，多為消腫止痛類藥，有一定毒性[10]。白花丹就是經(jīng)典瑤藥老班藥五虎之一，其毒性始終是制約其藥效的一個重要因素。

毒性藥材的炮制要兼顧“減毒”和“存效”兩個方面，不可偏廢，否則可能造成效失毒存，或毒去效失[11]。本文考察了白花丹炮制前后白花丹醌含量的變化，發(fā)現(xiàn)，黃酒炮制后其白花丹醌含量有所下降，同時，也考察了白花丹炮制前后的小鼠急性毒性，發(fā)現(xiàn)黃酒炮制能降低其急性毒性。但是本課題組成員在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，白花丹經(jīng)過炮制后，其長期毒性降低、抗CCl4肝損傷作用增強[12-13]。綜合本課題組的研究工作說明，白花丹經(jīng)過炮制后，確實能達(dá)到減毒增效的作用。至于白花丹醌是有效成分還是有毒成分，弄清白花丹毒-效關(guān)系，還有待更加深入的研究。

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ComparativestudyoncontentofplumbaginandAcutetoxicityofYaomedicine“Plumbagozeylanica”anditsprocessedproducts

Zhao xiangpei1Yu shengmin1Zhong ming2Chen shaofeng1*

1. Guangxi Institute of Minority Medical, Nanning 530001; 2. Guangxi Institute of Chinese Medicine and Pharmaceutical Science, Nanning 530012

Objective: To compare the content of plumbagin and the acute toxicity of Yao medicine “Plumbago zeylanica” and its processed products. Method: HPLC method was used to determine the content of plumbagin, and the classical method of acute toxicity was used to evaluate the acute toxicity of the Plumbago zeylanica and its processed products. Result: The content of plumbagin on Plumbago zeylanica and its processed products was separately 0.0136% and 0.0041%, and the MLD were respectively 88.7 and 99.5 g/kg. Conclusion: Proceeding has certain influence on the content of plumbagin and acute toxicity of plumbago zeylanica.

plumbago zeylanica; proceeding; plumbagin; acute toxicity

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項課題(GZBZ14-13), 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題(No.桂科能14123006-6)

趙湘培，女，助理研究員，民族藥藥理學(xué)研究，Tel：18101302217，E-mail：zhaoxiangpei@126.com。

*通訊作者：陳少鋒，男，副主任藥師，中藥、民族藥藥理研究工作。

R295.1

A

1006-6810(2017)08-0046-04

2017年5月31日收稿