張子通 張愛亮 陳啟悅 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

常見微生物快速檢測技術(shù)

張子通 張愛亮 陳啟悅 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

0 引言

微生物技術(shù)是人類21世紀三大科技革命之一，其對食品、醫(yī)學(xué)、材料等諸多領(lǐng)域都有著深遠的影響。作為微生物技術(shù)的基礎(chǔ)，微生物檢測技術(shù)的重要性不言而喻。微生物檢測的對象有細胞（細菌、單細胞生物、低等藻類等）及病毒，檢測指標包括數(shù)量、類別，較高要求的會涉及細胞的活性狀態(tài)等方面。

涂布法是傳統(tǒng)的微生物檢測方法?，F(xiàn)行國家標準GB 4789-2016《食品微生物檢測方法》的主體內(nèi)容就是一系列涂布方法：即在達到潔凈要求的實驗室里對樣品進行溶解稀釋，然后將不同比例稀釋的樣品液涂于相應(yīng)培養(yǎng)基表面，必要時取空白基參照，恒溫（一般是 35～37 ℃）培養(yǎng)一段時間（一般是 1～3 d）后進行菌落計數(shù)，其中計數(shù)可行有效的稀釋樣品用于計算原始樣品的濃度；依所測指標，試劑、器材、實驗條件亦會相應(yīng)調(diào)整。GB 4789-2016系列標準于2017年正式生效，代替了GB 4789-2010。雖然冠以“食品”之名，GB 4789-2016總則及其包含的各單獨方法對不同行業(yè)的微生物檢測都具有較高的指導(dǎo)性和代表性。譬如對于更嚴苛的藥品檢測，操作流程類似，但實驗室要求更高，同樣的指標培養(yǎng)時間一般會更長（5～7 d）。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，市場對微生物檢測的時效性和精密分析能力提出了較高要求，如：對食藥、生化流水線產(chǎn)品品質(zhì)的即時監(jiān)控；執(zhí)法部門、海關(guān)對樣品執(zhí)法、通關(guān)檢測；高端生化行業(yè)對特定菌種的大批量、高精度檢測。在這些訴求面前，經(jīng)典的涂布法在對實驗室要求高（包括硬件、環(huán)境、種類試劑耗材的采購制備）、對人員專業(yè)性和人數(shù)要求高、樣品培養(yǎng)時間長、無法檢測病毒等方面，其局限性日益顯現(xiàn)，故微生物快速檢測方法和儀器（以下簡稱速測方法、速測儀器）應(yīng)運而生。從21世紀初開始到現(xiàn)在，不同原理的速測方法都已經(jīng)取得了長足的進步，目前常見的儀器在可靠性、動作機構(gòu)等方面已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用的范圍也各自確立了。

新版GB 4789-2016整合了部分快速檢測方法。比如《PCR熒光法檢測諾如病毒》（GB 4789.42-2016，替代了原來只適用于貝類的SN/T 1635-2005《貝類的諾沃克病毒檢測方法》），填補了涂布法無法檢測病毒空白。在許多特定微生物檢測項目中，新標準也使用了PCR方法在涂布后用來確認物種?？梢哉f，我國對微生物的檢測在國家層面上也已經(jīng)順應(yīng)時勢進行了自我完善，PCR方法作為菌種判定和病毒檢測的標準方法的地位基本確立。

隨著速測方法在各個方面的應(yīng)用越來越廣泛，相關(guān)儀器的計量工作也勢在必行。目前國家尚無對此類儀器的統(tǒng)一的計量校準標準，非常重要的一個原因是因為儀器的種類豐富、原理各異、應(yīng)用條件也不同。故本文對常見的速測方法的原理特點、主要應(yīng)用領(lǐng)域進行概括歸納，既可以為未來的計量工作整合信息，同時在開展微生物速測工作時，對方法的選用，也可以提供一些建議和參照。

1 常見微生物快速檢測方法

1.1 快速測試卡（套裝）

快速測試卡（套裝）是對涂布方法通過技術(shù)手段盡可能簡化步驟來達到提速的一種微生物速測方法。這種方法技術(shù)成熟，成本低廉，攜帶方便，非常適合常見指標的現(xiàn)場檢測。該方法將實驗室培養(yǎng)基用含有營養(yǎng)物質(zhì)的預(yù)制“取樣-保存-培養(yǎng)”一體化的壓片、紙卡或小型容器替代，取樣涂布同時進行，取樣后的預(yù)制載體或直接用于培養(yǎng)，多無需稀釋，減輕了現(xiàn)場采樣和實驗室檢測的工作量，并且試圖通過改良培養(yǎng)物質(zhì)以求縮短某些指標的培養(yǎng)時間，但一般依舊難以短于12 h。

同時，亦有根據(jù)行業(yè)標準或其他特定需求專用的試紙型器材。這類器材通過色差，可定性表現(xiàn)或粗略定量地表現(xiàn)某些指標。其原理與涂布法稍有不同，多是通過特征菌與特定物質(zhì)反應(yīng)顯色而非涂布計數(shù)，但大多依舊無法繞開培養(yǎng)時間長這一瓶頸。其中比較典型的有餐具大腸桿菌專用試紙，其根據(jù)GB 14934-2016《消毒餐(飲）具》所述，在定性分析餐具大腸桿菌存否這一指標上和GB 4789.3-2016《大腸桿菌測試方法》等效。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)方法（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR方法）

PCR方法是一種比較快速的精密微生物檢測方法，其原理是利用DNA在95 ℃時變性成單鏈，低溫60 ℃左右時，引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再升溫至72 ℃左右，DNA聚合酶在此最佳活性溫度沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。由于原理上其直接復(fù)制目標堿基配對，故可非常準確地測量某一特定微生物種的數(shù)量。然而其存在假陽性概率較高的問題，原因是已死微生物的DNA鏈也會被檢出，所以排除干擾是實驗設(shè)計中的重要一環(huán)。此法可用于檢測病毒，國標中收錄的有GB 4789-2016.42《食品微生物檢測標準熒光法檢測諾如病毒》，還有在禽流感流行時期催生的GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》等。目前GB 4789-2016里所涉及的PCR方法主要為PCR熒光法，即對培養(yǎng)得到的堿基透過熒光物質(zhì)染色然后定量分析的做法。

除了與其他微生物檢測方法類似的注意點以外，由于此方法所涉及的生物反應(yīng)對溫度極度敏感，所以溫控準確是保障檢測可靠性的必須條件，故多作為實驗室的固定設(shè)備。目前存在用戶通過對溫控系統(tǒng)的校準來輔助判斷儀器可靠性的做法。

1.3 腺苷三磷酸熒光法（Adenosine Triphosphate Fluorescence，簡稱ATP熒光法）

ATP熒光法的基本原理是通過螢火蟲熒光素酶（簡稱蟲光素酶）催化螢火蟲熒光素（簡稱蟲熒光素）與生命體中常在能量物質(zhì)腺苷三磷酸在有氧狀態(tài)下發(fā)生氧化還原反應(yīng)發(fā)光。當蟲光素酶和蟲熒光素在體系中處于過量情況下，發(fā)光強弱取決于ATP 數(shù)量。只要排除非檢測項目因素的ATP，則可以通過發(fā)光強度直接求得目標量的數(shù)值。因此ATP法在應(yīng)對復(fù)雜的情況或是用于檢測特定項目時，需要追加前處理，一般較涂布法的培養(yǎng)基或是培養(yǎng)過程調(diào)整來說容易。如伍季等將此技術(shù)用于啤酒菌落總數(shù)的檢測：啤酒中含有其他有機活性物質(zhì)，他們通過追加了減壓過濾富集裝置，降低了啤酒中酶抑制劑和發(fā)光干擾的影響，達到的檢測線可達到10-15ATP，即相當于103cfu的菌落。

ATP法檢測速度一般為15～30 min，對現(xiàn)場要求比較低，無需培養(yǎng)，步驟少，誤操作、無效數(shù)據(jù)易被發(fā)覺，設(shè)備也已經(jīng)小型化，較之速測套裝依舊需要等待培養(yǎng)時間以及只能檢測基礎(chǔ)指標，可謂優(yōu)勢明顯，而且操作上，“取樣-儀器-讀數(shù)”的用戶體驗也更符合當代人操作習慣，故ATP技術(shù)是目前各技術(shù)中比較有潛力發(fā)展成“傻瓜”型民用或執(zhí)法用便攜產(chǎn)品的速測儀器。

1.4 流式細胞計數(shù)法（Flow Cytometer，簡稱FCM）

流式細胞計數(shù)法是基于細胞直接計數(shù)的一種微生物快速檢測方法，其基本原理是樣品流經(jīng)小孔時，檢測由于細胞存在而改變的環(huán)境參數(shù)，比如電傳導(dǎo)差、光散射、熒光標記，進而可以獲得細胞大小、數(shù)量等信息。結(jié)合其他條件，可以進行諸如病菌種類、細胞死活狀態(tài)等精密分析，已經(jīng)成為專業(yè)生物實驗室的重要裝備。流式細胞計數(shù)裝置一般由五大部分組成：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，該系統(tǒng)已經(jīng)進入到了微生物檢測的各個領(lǐng)域，以熒光標記為主要信號采集方式。該檢測方法速度較快，約為15 min，若進行連續(xù)批量操作，單個的平均時間更短。

除了用于精密分析，在批量分析的應(yīng)用中，流式細胞技術(shù)憑借其大批量以及在線處理能力所連帶的總成本下降，也具有一定優(yōu)勢。并且利用其原理上便能判斷細胞死活的特性，是常見速測方法里假陽性概率最低的方法。另外，流式細胞技術(shù)的應(yīng)變能力很強，在已經(jīng)有主體設(shè)備的情況下，如果需要拓展、改變檢測項目，流式細胞儀器往往只需要調(diào)整檢測程序，配合改變相應(yīng)的耗材即可，這使得該儀器實際利用率很高，盡管初期投入較大，不少企業(yè)依舊樂意使用。

1.5 阻抗法

微生物的活動會產(chǎn)生大分子電化學(xué)惰性物質(zhì)與小分子電化學(xué)活性物質(zhì)，可利用其對周遭電化學(xué)性質(zhì)的變化檢測微生物的數(shù)目。目前比較成熟的是阻抗法，即測量體系阻抗變化來推算微生物指標。

這種方法原理經(jīng)典成熟，儀器自身廉價，敏感度、可靠性、重復(fù)性都較好。該方法不需要對樣品進行復(fù)雜的前處理，因而在線檢測容易實現(xiàn)。其主要缺點在于其本質(zhì)只是檢測阻抗，而影響阻抗的因素非常多，其中不乏很多非生物性的因素，所以其檢測往往需要在某個固定環(huán)境下，阻抗變化才會和微生物的多少有關(guān)。張愛萍等對牛奶的菌落總數(shù)使用阻抗法進行檢測的試驗中，其檢測對象就是某特定批次的牛奶產(chǎn)品，其實驗結(jié)果充分說明了阻抗法在固定工況下檢測的優(yōu)勢。由于多用于檢測環(huán)境相對固定的諸如生產(chǎn)線監(jiān)測，其計量也必須是現(xiàn)場或是在線的校準。脫離工況狀態(tài)的校準只能判斷儀器功能的完整性，對于使用方并無意義。

2 結(jié)語

就本文所介紹的五種常見的微生物速測方法，這些方法各有所長，特點歸納到表1。

表1 常見微生物快速檢測方法歸納

總體來說，目前生物速測方法經(jīng)過十幾年的發(fā)展，各種技術(shù)都日趨成熟，在各自應(yīng)用上的準確度、可靠性上也都經(jīng)過了實踐檢驗，選擇上以任務(wù)特點導(dǎo)向為主，每個方法互為補充，不存在替代關(guān)系，更多是如同GB 4789-2016一般整合搭配使用，從而做到取長補短以提高總體的檢測質(zhì)量及能力。但對每種儀器的使用方法來說，未來如何尋求一個統(tǒng)一可行的標準來公證地校準不同速測儀器將會是計量工作的一個主要問題。

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