何忠梅，李成恩，段翠翠，趙玉娟，高 磊，欒 暢，張連學(xué)，李盛鈺,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

短梗五加果多酚預(yù)防大鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用

何忠梅1，李成恩1，段翠翠2，趙玉娟2，高 磊2，欒 暢2，張連學(xué)1，李盛鈺2,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

目的：研究短梗五加果多酚（Acanthopanax sessiliflorus fruit polyphenols，ASFP）對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）的預(yù)防作用，并探討其作用機(jī)制。方法：40 只雄性SD大鼠隨機(jī)平均分成4 組，每組10 只。采用高脂飲食結(jié)合腹腔注射VD3的方法建立As模型，不同劑量ASFP給藥組自造模開(kāi)始之日起分別灌胃150、75 mg/（kg·d）的ASFP，空白組和高脂飲食組大鼠灌胃等量生理鹽水，各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)處理12 周后，檢測(cè)大鼠血清生理生化水平并計(jì)算As指數(shù)；蘇木素-伊紅染色觀(guān)察大鼠主動(dòng)脈As病變情況；Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈中黏附分子和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與高脂飲食組相比，ASFP能顯著降低大鼠血清中的血脂、黏附分子和炎癥因子水平，減少主動(dòng)脈中的脂質(zhì)沉積，改善各層結(jié)構(gòu)排列紊亂，顯著降低主動(dòng)脈中細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、磷酸化p38和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phospho-extracellular signal regulated kinases 1/2，p-ERK1/2）的蛋白表達(dá)量。結(jié)論：ASFP具有預(yù)防As的作用，其作用可能與其降血脂和抑制p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

短梗五加果；多酚；動(dòng)脈粥樣硬化；降血脂；抗炎

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是一種影響大、中動(dòng)脈的慢性進(jìn)行性疾病，其中脂質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在其形成中起關(guān)鍵作用[1]，其主要臨床表現(xiàn)為：1）冠狀動(dòng)脈疾病，導(dǎo)致急性心肌梗死和心源性猝死；2）腦血管疾病，導(dǎo)致中風(fēng)；3）外周動(dòng)脈疾病，導(dǎo)致四肢和內(nèi)臟缺血[2]。因此，As及其誘發(fā)的并發(fā)癥是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)人群死亡的主要原因之一。目前用于防治As的藥物主要是一些他汀類(lèi)、貝特類(lèi)、煙酸類(lèi)等化學(xué)合成類(lèi)藥物，長(zhǎng)期服用毒副作用大[3]，因而從天然產(chǎn)物中尋找用于防治As的生物活性成分具有十分重要的意義。

植物多酚是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，具有毒副作用低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，關(guān)于植物多酚對(duì)As的預(yù)防和治療，前人已進(jìn)行了一些研究。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)玫瑰茄葉多酚提取物能夠上調(diào)肝臟X受體（LXRα）-三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）信號(hào)通路，進(jìn)而抑制氧化低密度脂蛋白氧化和泡沫細(xì)胞形成，從而防止As的形成；Xu Zherong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果多酚能夠通過(guò)抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶/核因子κB（mitogen-activated protein kinase/ nuclear factor κB，MAPK/NF-κB）的活化，減輕動(dòng)脈血管內(nèi)皮部位的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而預(yù)防As的形成；連冠等[6]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚提取物能通過(guò)降低血漿中的總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，減少泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而發(fā)揮抗As的作用；王振宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果多酚能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪代謝來(lái)預(yù)防As的發(fā)生。因此，從天然產(chǎn)物中提取植物多酚用于防治As具有十分重要的意義。

短梗五加（Acanthopanax sessiliflorus（Ruqr. et Maxim）Seem.），又稱(chēng)無(wú)梗五加，為五加科五加屬植物，在《本草綱目》和《中華本草》中均有記載，2008年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[8]。據(jù)報(bào)道，短梗五加果含有多糖類(lèi)、三萜類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)、花色苷類(lèi)、揮發(fā)性成分、酚酸類(lèi)等物質(zhì)[9]，具有抗炎、抗腫瘤、抗疲勞、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓和抗血小板凝集、抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞侵染和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等生物活性[10-16]，而關(guān)于短梗五加果多酚（Acanthopanax sessilif l orus fruit polyphenols，ASFP）對(duì)As是否有預(yù)防作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從短梗五加果中提取多酚，采用高脂飲食結(jié)合腹腔注射VD3的方法建立As大鼠模型，對(duì)ASFP預(yù)防As的作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究利用短梗五加果，開(kāi)發(fā)天然防治As的產(chǎn)品以及擴(kuò)大保健品來(lái)源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6～8 周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001。

短梗五加果為短梗五加的干燥成熟果實(shí)，由丹東五加高新農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。

D101大孔吸附樹(shù)脂 天津精細(xì)化工研究所；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料（83.3%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+3%膽固醇+3%白砂糖+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 公主嶺市鑫達(dá)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；VD3注射液上海通用藥業(yè)股份有限公司；大鼠TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、E-selection、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，I L-1 β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（m o n o c y t e chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒上海源葉生物科技有限公司；RIPA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular signal regulated kinases 1/2，ERK1/2）抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗ICAM-1抗體 美國(guó)Santa Cruz公司；抗VCAM-1抗體 英國(guó)Abcam公司；抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-p44/p42 MAPK抗體 美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP124S分析天平 德國(guó)Sartorius公司；DHP-9 272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；BX 50光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；Cary 300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Varian公司；電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司；ChemiScope 5600一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ASFP的制備

3 kg干燥的短梗五加果分別用10、8倍體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇80 ℃回流提取2次，每次1 h，合并提取液，300 目濾布過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇后凍干，得短梗五加果粗多酚。將短梗五加果粗多酚進(jìn)行D101大孔樹(shù)脂柱純化，依次用蒸餾水、30%、50%、70%和95%的乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫得到的組分，回收乙醇，減壓濃縮后冷凍干燥即得ASFP。參照文獻(xiàn)[17]的方法，以綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)品，建立線(xiàn)性回歸方程為y＝17.99x+0.004，R2＝0.999 6。紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.3%（以綠原酸計(jì)），經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)其主要成分為金絲桃苷、1,3-二咖啡?？鼘幩帷?,4-二咖啡?？鼘幩岷?,5-二咖啡酰奎寧酸。

1.3.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

40 只大鼠經(jīng)過(guò)1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分成4 組（n＝10）：空白組（control group，CON），給予基礎(chǔ)飼料；模型組，即高脂飲食組（high fat diet group，HFD）；ASFP給藥組：HFD+150 mg/（kg·d）ASFP、HFD+75 mg/（kg·d）ASFP?？瞻捉M和高脂飲食組大鼠灌胃等量生理鹽水，ASFP給藥組分別按照150、75 mg/（kg·d）的劑量灌胃大鼠。高脂飲食組和ASFP給藥組大鼠于首次喂養(yǎng)的第3、5、7天按照700 000 U/kg的劑量腹腔注射VD3注射液，空白組腹腔注射等量生理鹽水。除空白組飼喂基礎(chǔ)飼料外，其余3 組大鼠均飼喂高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12 周，所有大鼠自由飲用蒸餾水。12 周后，禁食12 h后稱(chēng)量所有大鼠體質(zhì)量，以2 g/100 mL戊巴比妥鈉鹽溶液腹腔注射麻醉，心臟取血，血液于3 000 r/min、4 ℃下離心15 min后分離上層血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中備用。剝離胸主動(dòng)脈，于預(yù)冷的生理鹽水中反復(fù)沖洗干凈后，取0.5 cm左右長(zhǎng)的胸主動(dòng)脈置于10%的福爾馬林溶液中固定，4 ℃冰箱中保存用于后續(xù)組織病理學(xué)觀(guān)察，其余胸主動(dòng)脈置于EP管中-80 ℃保存用于后續(xù)Western blot檢測(cè)。

1.3.3 大鼠血清生理生化指標(biāo)測(cè)定

取1.3.2節(jié)中制備的血清，按照雙抗體夾心按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA檢測(cè)大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ICAM-1、VCAM-1、E-selection、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、IFN-γ的水平，并按下式計(jì)算As指數(shù)（atherosclerosis index，AI）。

式中：cTC和cHDL-C分別為測(cè)定得到的TG和HDL-C濃度/（mmol/L）。

1.3.4 大鼠胸主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀(guān)察

取1.3.2節(jié)用10%福爾馬林溶液固定的各組大鼠胸主動(dòng)脈，參照文獻(xiàn)[18]的方法，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察主動(dòng)脈病變。

1.3.5 黏附分子和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)

取1.3.2節(jié)中-80 ℃冰箱中凍存的各組大鼠主動(dòng)脈組織，按照RIPA蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取蛋白，Western blot法檢測(cè)主動(dòng)脈中ICAM-1、VCAM-1、總p38（total p38，t-p38）、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、總ERK1/2（total ERK1/2，t-ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2 ，p-ERK1/2）蛋白的表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASFP對(duì)大鼠血清血脂水平的影響

表1 ASFP對(duì)大鼠血清血脂和AI的影響Table 1 Effect of ASFP on serum lipids and AI in rats

AI是反映脂質(zhì)代謝紊亂的一個(gè)綜合性指標(biāo)，是預(yù)測(cè)、衡量As危險(xiǎn)度的可靠指標(biāo)之一，AI數(shù)值越小，說(shuō)明As的程度越低或在減輕，AI數(shù)值越大，說(shuō)明As的程度越高。由表1可知，與高脂飲食組相比，ASFP各給藥組大鼠的TC、LDL-C、TG（除HFD+150 mg/（kg·d）ASFP大鼠外）含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），HFD+150 mg/（kg·d）ASFP大鼠TG含量也降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），ASFP各給藥組大鼠AI極顯著減?。≒＜0.01），說(shuō)明ASFP可以顯著降低TC、TG、LDL-C的水平，減小AI指數(shù)，預(yù)防As的發(fā)生。

2.2 ASFP對(duì)大鼠的血清黏附分子水平的影響

表2 ASFP對(duì)大鼠血清黏附分子水平的影響Table 2 Effect of ASFP on serum adhesion molecules in rats

在As斑塊形成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1等黏附分子，促進(jìn)炎性細(xì)胞遷移與浸潤(rùn)，吸引大量單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下成為泡沫細(xì)胞從而促進(jìn)As發(fā)生、發(fā)展[19]。由表2可知，與空白組相比，高脂飲食組大鼠血清ICAM-1、VCAM-1、E-selection水平均極顯著升高（P＜0.01），而灌胃150、75 mg/（kg·d）ASFP的大鼠ICAM-1、VCAM-1和E-selection（除HFD+150 mg/（kg·d）ASFP）水平極顯著降低（P＜0.01），HFD+150 mg/（kg·d）ASFP 的E-selection含量也降低但無(wú)顯著差異（P＞0.05），提示ASFP可以通過(guò)顯著降低大鼠血清黏附分子水平預(yù)防As的發(fā)生。

2.3 ASFP對(duì)大鼠的血清炎癥因子水平的影響

表3 ASFP對(duì)大鼠血清炎癥因子水平的影響Table 3 Effect of ASFP on serum inf l ammatory cytokines in rats

由表3可知，與空白組相比，高脂飲食組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、IFN-γ水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與高脂飲食組相比，給予150 mg/（kg·d）ASFP灌胃處理的大鼠TNF-α、IL-1β、MCP-1的水平分別降低了11.02%、20.97%、11.44%，IL-6和IFN-γ水平下降但不顯著（P＞0.05）；給予75 mg/（kg·d）ASFP灌胃處理大鼠的TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、IFN-γ水平分別降低了12.92%、15.28%、13.06%、15.25%、6.85%。結(jié)果表明，ASFP可以降低As大鼠的血清炎癥因子水平。

2.4 ASFP對(duì)大鼠As形成的影響

圖1 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化的影響（×1 000）Fig. 1 Effect of ASFP on changes in histopathological characteristics of the aorta in rats (× 1 000)

由圖1可知，HE染色切片顯示空白組大鼠主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)正常、排列整齊，內(nèi)膜光滑，中膜彈力纖維正常；高脂飲食組各層結(jié)構(gòu)排列紊亂，內(nèi)膜和中膜細(xì)胞排列疏松，與空白組相比有較多的脂質(zhì)沉積，有的內(nèi)膜斷裂脫落；ASFP各給藥組脂質(zhì)沉積均較高脂飲食組減少，各層結(jié)構(gòu)排列紊亂現(xiàn)象明顯改善。觀(guān)察結(jié)果表明，ASFP可以預(yù)防大鼠As的形成。

2.5 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

圖2 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織中的ICAM-1、VCAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of ASFP on the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the aorta of rats

由圖2可知，空白組大鼠主動(dòng)脈組織中ICAM-1和VCAM-1呈低水平表達(dá)，與空白組相比，高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈組織中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），而ASFP 150、75 mg/（kg·d）ASFP灌胃處理大鼠主動(dòng)脈中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)量均極顯著減少（P＜0.01），這與2.2節(jié)中血清中黏附分子的檢測(cè)結(jié)果相一致，表明ASFP可以通過(guò)顯著降低As大鼠主動(dòng)脈組織中黏附分子的表達(dá)，預(yù)防As的發(fā)生。

2.6 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈中p38 MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)的影響

圖3 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織中p-p38蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of ASFP on the expression of p-p38 in the aorta of rats

由圖3可知，空白組大鼠主動(dòng)脈組織中p-p38蛋白呈低水平表達(dá)，且在各組（除高脂飲食組）主動(dòng)脈組織中表達(dá)量無(wú)顯著差異；與空白組相比，高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈組織中p-p38蛋白的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），表明高脂飲食能夠上調(diào)p38 MAPK信號(hào)通路的表達(dá)；與高脂飲食組相比，ASFP給藥組大鼠主動(dòng)脈組織中p-p38蛋白的表達(dá)量均極顯著減少（P＜0.01），表明ASFP能夠抑制高脂飲食引起的p38 MAPK信號(hào)通路的上調(diào)。結(jié)果表明，ASFP可能通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路預(yù)防大鼠As的形成。

2.7 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈中ERK1/2 MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)的影響

由圖4可知，空白組大鼠主動(dòng)脈組織中p-ERK1/2蛋白呈低水平表達(dá)，且在各組（除高脂飲食組）主動(dòng)脈組織中表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與空白組相比，高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈組織中p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），表明高脂飲食能夠引起p-ERK1/2 MAPK信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)；而ASFP給藥組大鼠的主動(dòng)脈組織中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均極顯著減少（P＜0.01），表明ASFP能夠顯著抑制大鼠主動(dòng)脈組織中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。綜上表明，ASFP可能通過(guò)抑制p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信號(hào)通路預(yù)防大鼠As的形成。

圖4 ASFP對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織中p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of ASFP on the expression of p-ERK1/2 in the aorta of rats

3 討 論

目前，高脂血癥被認(rèn)為是As的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，在As斑塊的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。高脂血癥的特征是高膽固醇和高甘油三酯，這些脂質(zhì)可以與As載脂蛋白（apolipoprotein，Apo），如低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等結(jié)合后形成LDL-C、極低密度脂蛋白膽固醇被運(yùn)送到動(dòng)脈壁，從而導(dǎo)致脂質(zhì)在動(dòng)脈壁的沉積和引發(fā)As[21]。本研究中，與空白組相比，僅喂食高脂飼料的大鼠的TC、TG、LDL-C的含量和AI指數(shù)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而灌胃150、75 mg/（kg·d）ASFP的大鼠的TC、TG、LDL-C水平和AI較高脂飲食組均有不同程度的降低，揭示了ASFP具有較好的降血脂的能力，這與Kim等[22]的報(bào)道相一致。ASFP可以通過(guò)降低血漿中TC、TG和LDL-C含量以及AI來(lái)預(yù)防As的發(fā)生。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，As是一種由多種炎性細(xì)胞因子過(guò)度釋放引起的慢性炎癥性疾病[23]。據(jù)報(bào)道，血液中的LDL-C是一種重要的炎性誘導(dǎo)劑，能夠引起動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化并誘導(dǎo)黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1）表達(dá)量的增加，產(chǎn)生的黏附分子募集炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞和T細(xì)胞黏附到早期的As病變區(qū)域并加速As的形成[24]。本研究中，與空白組相比，喂食高脂飲食的大鼠血清中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)量均升高，但是這種升高可以被ASFP抑制或阻斷，隨后的Western blot分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，這提示ASFP可以通過(guò)抑制ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的升高來(lái)預(yù)防As的發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MCP-1是一種在As的起始和發(fā)展階段起關(guān)鍵作用的炎癥細(xì)胞因子，它能夠吸引炎癥細(xì)胞黏附到As病變區(qū)域，進(jìn)而促進(jìn)As的形成[25]。在As病變區(qū)域，除了有黏附分子分泌，還有血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)攝取氧化低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞并進(jìn)一步放大局部炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6和IL-1β是用于反映As的具有代表性的促炎細(xì)胞因子[26]。Ohta等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與ApoE基因缺失小鼠相比，TNF-α基因缺失的ApoE小鼠在主動(dòng)脈竇的As斑塊減小，并且ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表達(dá)量也降低，這說(shuō)明TNF-α能夠通過(guò)上調(diào)動(dòng)脈壁中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表達(dá)促進(jìn)As發(fā)生。目前，抗TNF-α療法已應(yīng)用于治療或減輕心血管疾病中，它通過(guò)降低慢性炎癥反應(yīng)而不改變血漿中TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平發(fā)揮作用[28]。IL-1β是一種主要由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，它主要是通過(guò)誘導(dǎo)主動(dòng)脈中VCAM-1和MCP-1的過(guò)度表達(dá)來(lái)加快炎性細(xì)胞募集到As病變區(qū)域的速度[29]。與之相對(duì)應(yīng)，缺失IL-1β的ApoE小鼠的As斑塊面積比ApoE小鼠顯著減少[30]。近年來(lái)，IL-6被認(rèn)為是代謝病和心血管疾病的危險(xiǎn)因素，Schieffer等[31]應(yīng)用As小鼠模型研究IL-6在As中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-6能促進(jìn)As細(xì)胞因子的形成。本研究中，與空白組相比，飼喂高脂飼料的大鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，而這種升高能被灌胃不同劑量的ASFP抑制，表明ASFP可能通過(guò)降低炎癥因子MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，從而預(yù)防As的發(fā)生。

MAPK信號(hào)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，能夠?qū)⒓?xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，從而引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。研究證實(shí)，激活p38 MAPK，能夠通過(guò)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)其下游VCAM-1、ICAM-1等黏附分子基因的表達(dá)，進(jìn)而加速As的形成[32]。李晶晶等[33]研究發(fā)現(xiàn)，多廿烷醇的抗As作用除了得益于其調(diào)脂作用外，還與其能夠抑制血清超敏C反應(yīng)蛋白和p38 MAPK的磷酸化有關(guān)。本研究中，Western blot結(jié)果顯示，與飼喂正常飼料的大鼠相比，高脂飲食組大鼠p-p38、p-ERK/1/2蛋白含量增加，而灌胃ASFP的大鼠能夠抑制p-p38、p-ERK/1/2表達(dá)量的增加。結(jié)果表明，ASFP可以抑制MAPK信號(hào)通路中p38、ERK1/2蛋白的激活，ASFP可能通過(guò)抑制p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信號(hào)通路的上調(diào)產(chǎn)生抗As的作用。

綜上所述，ASFP可以通過(guò)降低血脂水平和抑制炎癥因子的表達(dá)預(yù)防As的發(fā)生，其抗As的作用機(jī)制可能與其抑制MAPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)，關(guān)于ASFP是否還通過(guò)其他途徑預(yù)防As的發(fā)生還有待于進(jìn)一步的研究。

[1] SWIRSKI F K, NAHRENDORF M. Leukocyte behavior in atherosclerosis, myocardial infarction, and heart failure[J]. Science,2013, 339: 161-166. DOI:10.1126/science.1230719.

[2] LIBBY P. Inflammation in atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology, 2012, 32(9): 2045-2051.DOI:10.1161/ATVBAHA.108.179705.

[3] 郭建, 趙國(guó)君, 王小玲. 藥物預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 38(3): 264-267; 272. DOI:10.16343/j.cnki.issn.2095-512x.2016.03.018.

[4] CHEN J H, WANGC C J, WANGD C P, et al. Hibiscus sabdariffa leaf polyphenolic extract inhibits LDL oxidation and foam cell formation involving up-regulation of LXRα/ABCA1 pathway[J]. Food Chemistry,2013, 141(1): 397-406. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.03.026.

[5] XU Zherong, LI Jinyou, DONG Xinwei, et al. Apple polyphenols decrease atherosclerosis and hepatic steatosis in ApoE mice through the ROS/MAPK/NF-κB pathway[J]. Nutrients, 2015, 7(8): 7085-7105.DOI:10.3390/nu7085324.

[6] 連冠, 魚(yú)毛毛, 徐璐, 等. 葡萄籽多酚降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志, 2015, 23(2): 121-126.

[7] 王振宇, 周麗萍, 劉瑜. 蘋(píng)果多酚對(duì)小鼠脂肪代謝的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(9): 288-291.

[8] 衛(wèi)生部批準(zhǔn)7 種新資源食品[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8(3): 67.

[9] 李鶴, 胡文忠, 姜愛(ài)麗, 等. 短梗五加各部位活性成分及其食藥用價(jià)值研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(6): 372-376. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.066.

[10] LEE D Y, SEO K H, JEONG R H, et al. Anti-inf l ammatory lignans from the fruits of Acanthopanax sessiliflorus[J]. Molecules, 2013,18(1): 41-49. DOI:10.3390/molecules18010041.

[11] LEE S J, HONG S, YOO S H, et al. Cyanidin-3-O-sambubioside from Acanthopanax sessilif l orus fruit inhibits metastasis by downregulating MMP-9 in breast cancer cells MDA-MB-231[J]. Planta Medica, 2013,79(17): 1636-1640. DOI:10.1055/s-0033-1350954.

[12] 管美玉, 劉玉強(qiáng), 才謙, 等. 無(wú)梗五加果實(shí)抗疲勞活性研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2015, 11(19): 10-12. DOI:10.11954/ytctyy.201519005.

[13] 賀小露, 張蕊, 孫明亮, 等. 短梗五加果鎮(zhèn)靜催眠作用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥材, 2013, 36(8): 1329-1331. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.08.034.

[14] SONG Y, YANG C J, YU K, et al. In vivo antithrombotic and antiplatelet activities of a quantif i ed Acanthopanax sessilif l orus fruit extract[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2011, 9(2): 141-145.DOI:10.3724/SP.J.1009.2011.00141.

[15] 馮穎, 孟憲軍, 王建國(guó), 等. 無(wú)梗五加果多糖組成及生物活性的研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(4): 378-380.

[16] LEE J W, BEAK N I, LEE D Y. Inhibitory effects of seco-triterpenoids from Acanthopanax sessilif l orus fruits on HUVEC invasion and ACE activity[J]. Natural Product Communications, 2015, 10(9): 1517-1520.

[17] 李春芳, 劉汶, 曲佳琳, 等. 短梗五加果提取物中總黃酮、總酚及3 種指標(biāo)成分的含量測(cè)定[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(10):801-806. DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2011.10.004.

[18] LI J, CHEN C X, SHEN Y H. Effects of total glucosides from paeony(Paeonia lactiflora Pall) roots on experimental atherosclerosis in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 135(2): 469-475.DOI:10.1016/j.jep.2011.03.045.

[19] FENYO I M, GAFENCU A V. The involvement of the monocytes/macrophages in chronic inflammation associated with atherosclerosis[J]. Immunobiology, 2013, 218(11): 1376-1384.DOI:10.1016/j.imbio.2013.06.005.

[20] DRECHSLER M, MEGENS R T A, ZANDVOORT M V,et al. Hyperlipidemia-triggered neutrophilia promotes early atherosclerosis[J]. Circulation, 2010, 122(18): 1837-1845.DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.110.961714.

[21] TABAS I, WILLIAMS K J, BOREN J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis[J]. Circulation, 2007,116(16): 1832-1844. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.106.676890.

[22] KIM S, KIM C K, LEE K S, et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid prof i le and inhibiting NF-κB activation via phaseⅡ gene expression[J].Journal of Ethnopharmacology, 2013, 146 (2): 515-524. DOI:10.1016/j.jep.2013.01.016.

[23] MONTERO-VEGA M T. the Inflammatory process underlying atherosclerosis[J]. Critical Reviews in Immunology, 2012, 32(5): 373-462. DOI:10.1615/CritRevImmunol.v32.i5.10.

[24] WEBER C, NOELS H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options[J]. Nature Medicine, 2011, 17(11): 1410-1422.DOI:10.1038/nm.2538.

[25] GU L, OKADA Y, CLINTON S K, et al. Absence of monocyte chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-def i cient mice[J]. Molecular cell, 1998, 2(2): 275-281. DOI:10.1016/S1097-2765(00)80139-2.

[26] AIT-OUFELLA H, TALEB S, MALLAT Z, et al. Recent advances on the role of cytokines in atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology, 2011, 31(5): 969-979.DOI:10.1161/ATVBAHA.110.207415.

[27] OHTA H, WADA H, NIWA T, et al. Disruption of tumor necrosis factor-α gene diminishes the development of atherosclerosis in ApoE-def i cient mice[J]. Atherosclerosis, 2005, 180(1): 11-17. DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2004.11.016.

[28] SOUBRIER M, JOUNAEL P, MATHIEU S, et al. Effects of antitumor necrosis factor therapy on lipid profile in patients with rheumatoid arthritis[J]. Joint Bone Spine, 2008, 75(1): 22-24. DOI:10.1016/j.jbspin.2007.04.014.

[29] BHASKAR V, YIN J, MIRZA A M, et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-def i cient mice[J]. Atherosclerosis, 2011, 216(2): 313-320. DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2011.02.026.

[30] KIRII H, NIWA T, YAMADA Y, et al. Lack of interleukin-1β decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice[J].Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2003, 23: 656-660. DOI:10.1161/01.ATV.0000064374.15232.C3.

[31] SCHIEFFER B, SELLE T, HILFIKER A, et al. Impact of interleukin-6 on plaque development and morphology in experimental atherosclerosis[J]. Circulation, 2004, 110(22): 3493-3500.DOI:10.1161/01.CIR.0000148135.08582.97.

[32] JERSMANN H P A, HII C S T, FERRANTE J V, et al. Bacterial lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha synergistically increase expression of human endothelial adhesion molecules through activation of NF-κB and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways[J]. Infection and Immunity, 2001, 69(3): 1273-1279. DOI:10.1128/IAI.69.3.1273-1279.2001.

[33] 李晶晶, 田乃亮, 朱中生, 等. 多廿烷醇抗動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制研究[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 32(5): 650-654.

Preventive Effect of Polyphenols Isolated from Acanthopanax sessilif l orus Fruits on Atherosclerosis in Rats

HE Zhongmei1, LI Cheng’en1, DUAN Cuicui2, ZHAO Yujuan2, GAO Lei2, LUAN Chang2, ZHANG Lianxue1, LI Shengyu2,*
(1. College of Traditional Chinese Medicine Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;2. Institute of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

Objective: A rat model was used to investigate the preventive effect of Acanthopanax sessiliflorus fruit polyphenols (ASFP) on atherosclerosis (As) and the underlying mechanism was explored. Methods: The atherosclerosis model was built by feeding rats with high-fat diet (HFD) combined with intraperitoneal injection with vitamin D3. Forty male rats were randomly divided into four groups (n = 10): control, HFD, HFD + low-dose ASFP and HFD + high-dose ASFD groups. The rats from the ASFD-treat groups were daily administered with 150 or 75 mg/(kg·d) ASFP during the HFD feeding period of 12 days, while those from the control and HFD groups were given an equal volume of normal saline.Serum biochemical parameters were detected and atherosclerosis index (AI) was calculated at the end of administration.Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the atherosclerosis lesion in the aorta of rats. The expression levels of adhesion molecules in the aorta and key genes involved mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway were measured by Western blot. Results: The levels of blood lipids, adhesion molecules and inflammatory cytokines in rats were signif i cantly decreased by ASFP compared with the model group. In addition, after treatment with ASFP, aortic lipid deposition was reduced and the structure of disordered layers was signif i cantly improved compared with the model group. Furthermore, the expression of intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1), phospho-p38 (p-p38) and phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) in the rat aorta were significantly down-regulated by treatment with ASFP compared with the model group. Conclusion: ASFP plays an important role in preventing atherosclerosis, which may be related to the reduction of blood lipids and the inhibition of p38 MAPK and ERK1/2 MAPK signaling pathways, thereby inhibiting the expression of inf l ammatory cytokines.

Acanthopanax sessilif l orus; polyphenols; atherosclerosis; blood lipid-lowering; anti-inf l ammatory

10.7506/spkx1002-6630-201801030

TS201.4

A

1002-6630（2018）01-0200-07

2016-10-17

長(zhǎng)春市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新示范點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（16CX20）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-36）；“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（2016YFC0500300）；吉林省中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（20140311029YY）

何忠梅（1978—），女，副教授，博士，主要從事天然藥物有效成分作用機(jī)理及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。E-mail：1285737655@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李盛鈺（1977—），男，副研究員，博士，主要從事發(fā)酵食品及乳品加工研究。E-mail：lisy720@126.com

何忠梅, 李成恩, 段翠翠, 等. 短梗五加果多酚預(yù)防大鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 200-206.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801030. http://www.spkx.net.cn

HE Zhongmei, LI Cheng’en, DUAN Cuicui, et al. Preventive effect of polyphenols isolated from Acanthopanax sessilif l orus fruits on atherosclerosis in rats[J]. Food Science, 2018, 39(1): 200-206. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801030. http://www.spkx.net.cn