廖魯燕 趙明偉 楊國(guó)峰

·論著·

RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值

廖魯燕 趙明偉 楊國(guó)峰

目的探討RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing,SAT-TB)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值。方法選取2014年6月至2016年6月聊城市傳染病醫(yī)院收治的有胸腔積液的患者210例作為研究對(duì)象，其中143例臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎，作為結(jié)核性胸膜炎組；其余67例患者作為對(duì)照組。應(yīng)用涂片法、改良羅氏培養(yǎng)法、SAT-TB法檢測(cè)研究對(duì)象胸腔積液標(biāo)本，比較各檢測(cè)方法的檢測(cè)效能。結(jié)果SAT-TB檢測(cè)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為36.36%(52/143)、98.51%(66/67)、98.11(52/53)、42.04%(66/157)。SAT-TB檢測(cè)的敏感度明顯高于涂片法[3.50%(5/143)]及羅氏培養(yǎng)法[20.28%(29/143)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.08，P=0.021；χ2=9.12，P<0.01)。SAT-TB法檢測(cè)完成時(shí)間為1～2 h，羅氏培養(yǎng)法完成時(shí)間為6～8周。結(jié)論SAT-TB法能快速檢測(cè)胸腔積液中的結(jié)核分枝桿菌，敏感度高于涂片法和羅氏培養(yǎng)法。

胸腔積液； 分枝桿菌，結(jié)核； 核酸擴(kuò)增技術(shù)； 評(píng)價(jià)研究

胸腔積液是胸膜疾病最常見的臨床表現(xiàn)，可以由多種疾病引起，在結(jié)核病疫情高發(fā)地區(qū)，結(jié)核病是胸腔積液的常見誘因[1]。目前，結(jié)核性胸腔積液診斷主要是依據(jù)其典型臨床癥狀、胸部X線攝影、結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))、胸腔積液檢查和診斷性抗結(jié)核治療有效進(jìn)行臨床診斷，容易存在誤診和漏診。臨床確診的傳統(tǒng)方法仍是胸腔積液涂片鏡檢法及分枝桿菌培養(yǎng)法，但胸腔積液涂片法陽性率低，而培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)。RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)(simultaneous amplification and testing，SAT-TB)是一項(xiàng)基于RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展的核酸檢測(cè)技術(shù)，它是以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)特異的16S rRNA作為檢測(cè)靶標(biāo)，通過恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有MTB[2]。本研究比較抗酸染色法、改良羅氏培養(yǎng)法、SAT-TB法檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液中MTB的效能，旨在探討SAT-TB對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值。

對(duì)象和方法

1.研究對(duì)象：選取2014年6月至2016年6月聊城市傳染病醫(yī)院收治的胸腔積液患者作為研究對(duì)象，共210例，其中143例臨床診斷結(jié)核性胸膜炎，作為結(jié)核性胸膜炎組；其余67例患者作為對(duì)照組。

2.結(jié)核性胸膜炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)有發(fā)熱、乏力、盜汗、納差、消瘦等典型結(jié)核全身中毒癥狀。(2)PPD試驗(yàn)強(qiáng)陽性(硬結(jié)平均直徑>15 mm)，或出現(xiàn)水皰、壞死及淋巴管炎和(或)血清結(jié)核抗體陽性。(3)胸部X線攝影及B超檢查顯示胸腔積液及肺內(nèi)或其他部位有與結(jié)核病相符的病變。(4)實(shí)驗(yàn)室檢查(常規(guī)和生化)符合結(jié)核性滲出液特點(diǎn)，即白細(xì)胞增高，以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主；胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)>45 U/L；胸腔積液ADA/血清ADA比值>1。(5)診斷性抗結(jié)核藥物治療有效。

3.儀器和試劑：分枝桿菌涂片鏡檢萋-尼染色液、羅氏培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；SAT-TB試劑盒購(gòu)自上海仁度生物有限公司(批號(hào)：20140203)。

4.檢測(cè)方法：留取研究對(duì)象胸腔積液30 ml，分成3份，用于抗酸桿菌涂片、SAT-TB檢測(cè)、羅氏培養(yǎng)法與菌種鑒定檢測(cè)。(1)胸腔積液涂片及培養(yǎng)操作：嚴(yán)格按照結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程執(zhí)行[4]。(2)SAT-TB檢測(cè)：根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。將胸腔積液加4%的NaOH液化10 min，取1 ml離心，離心半徑8 cm，13 000 r/min 離心5 min；棄上清液，加入1 ml生理鹽水重懸洗滌，離心半徑8 cm，13 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入50 μl稀釋液重懸，制成待測(cè)樣本。將樣本放入核酸提純儀超聲破碎15 min，超聲功率300 W。取2 μl處理物加入含30 μl擴(kuò)增液中，置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，同時(shí)開啟恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器，按儀器操作手冊(cè)設(shè)定反應(yīng)程序。熒光素通道設(shè)定為羧基熒光素(FAM)，42 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集每分鐘進(jìn)行1次，共檢測(cè)40次。反應(yīng)結(jié)束后置于恒溫混勻儀上42 ℃保溫5 min，同時(shí)將酶液預(yù)熱到42 ℃加入反應(yīng)管，快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算檢測(cè)效能指標(biāo)，包括敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值；對(duì)涂片法、SAT-TB法、羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)敏感度的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.基本情況：結(jié)核性胸膜炎組143例，其中男78例，女65例；平均年齡(33.92±11.05)歲。對(duì)照組67例，其中男41例，女26例；平均年齡(42.53±13.94)歲；包括胸膜轉(zhuǎn)移瘤45例，胸膜間皮瘤11例，肺炎旁積液8例，肺栓塞3例。腫瘤患者均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診；肺炎患者經(jīng)痰液細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)出致病菌，應(yīng)用抗生素后肺部病灶吸收好轉(zhuǎn)，胸腔積液消失；肺栓塞患者經(jīng)肺動(dòng)脈造影明確診斷。

2.檢測(cè)結(jié)果比較：對(duì)143例結(jié)核性胸膜炎組患者進(jìn)行胸腔積液檢測(cè)，SAT-TB法檢測(cè)完成時(shí)間為1～2 h，羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)完成時(shí)間為6～8周。涂片法檢測(cè)陽性率為3.50%(5/143)，羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)陽性率為20.28%(29/143)，SAT-TB法檢測(cè)陽性率為36.36%(52/143)；29例培養(yǎng)及菌種鑒定陽性的患者有2例SAT-TB法檢測(cè)陰性。

3.檢測(cè)效能比較：以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT-TB法檢測(cè)敏感度為36.36%(52/143)，高于涂片法(3.50%，5/143)和羅氏培養(yǎng)法(20.28%，29/143)，羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)敏感度高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.08，P=0.021)；SAT-TB法檢測(cè)敏感度高于羅氏培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.12，P<0.01)(表1)。

表1 不同檢測(cè)方法在結(jié)核性胸膜炎組與對(duì)照組患者中的檢測(cè)效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

討 論

結(jié)核性胸膜炎是臨近胸膜的結(jié)核病灶直接侵犯胸膜或分枝桿菌經(jīng)淋巴管血行播散至胸膜引起的滲出性炎癥，由于進(jìn)入胸腔的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量少，在患者的胸腔積液中很難找到細(xì)菌學(xué)的證據(jù)[5]。由于結(jié)核分枝桿菌是直接導(dǎo)致結(jié)核性胸膜炎的原因，獲得直接的細(xì)菌學(xué)證據(jù)是診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，用快速抗酸染色法對(duì)普通結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液進(jìn)行檢測(cè)的陽性率不到10%[7]，而細(xì)菌培養(yǎng)方法的敏感度僅在30%左右。本研究中，涂片法檢測(cè)陽性率為3.50%，羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)陽性率為20.28%。并且，固體培養(yǎng)與菌種鑒定需要6～8周的時(shí)間，即使使用BACTEC MGIT 960技術(shù)，也需要3～6周，往往會(huì)延誤診治[8]。因此，需要一種快速敏感的檢測(cè)手段進(jìn)行補(bǔ)充。

SAT-TB法是以結(jié)核分枝桿菌特異的16S rRNA為靶標(biāo)，通過恒溫RNA擴(kuò)增技術(shù)，熒光標(biāo)記的探針和靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌存在[9]。筆者對(duì)143例結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液采用羅氏培養(yǎng)法及SAT-TB檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)的陽性率分別為20.28%和36.36%，均明顯高于涂片法檢測(cè)的陽性率(3.50%)。本研究中，SAT-TB檢測(cè)胸腔積液陽性率與文獻(xiàn)報(bào)道的34.04%基本一致[10]，也明顯高于羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)陽性率，說明應(yīng)用SAT-TB法檢測(cè)對(duì)于結(jié)核性胸膜炎的診斷具有輔助價(jià)值，且更加快速、高效。29例患者培養(yǎng)及菌種鑒定陽性的患者有2例應(yīng)用SAT-TB法檢測(cè)為陰性；假陰性結(jié)果的出現(xiàn)考慮與RNA在環(huán)境中極易降解[11]，標(biāo)本放置時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。67例對(duì)照組患者，有1例應(yīng)用SAT-TB法檢測(cè)陽性；假陽性結(jié)果的出現(xiàn)可能是胸腔積液分裝送檢過程中造成污染所致，提示雖然RNA極易降解，可有效避免污染，但在標(biāo)本分裝、送檢、實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)節(jié)中仍有出現(xiàn)標(biāo)本污染的可能[12]。因此，在實(shí)際操作過程中，需要嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，防止因人為因素導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

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Thediagnosisvalueofsimultaneousamplificationandtestingfortuberculouspleuraleffusion

LIAOLu-yan*,ZHAOMing-wei,YANGGuo-feng.

*DepartmentofTuberculosis,LiaochengInfectiousDiseaseHospital,Liaocheng252000,China

ZHAOMing-wei,Email: 419790064@qq.com

ObjectiveTo evaluate the diagnosis value of simultaneous amplification and testing (SAT-TB) for tuberculous pleural effusion.MethodsTwo hundred and ten cases with pleural effusion admitted from Liaocheng Infectious Disease Hospital from June 2014 to June 2016 were selected as the subjects.Among them,143 patients were clinically diagnosed as tuberculous pleurisy (defined as tuberculous pleurisy group,while the remaining 67 patients were defined as the control group.The specimens of pleural effusion were collected from all subjects and analyzed by the smear test,modified Roche culture method and SAT-TB method.The detection performances of the three methods were compared.ResultsThe sensitivity,specificity,positive predictive value,and negative predictive value of SAT-TB were 36.36% (52/143),98.51% (66/67),98.11 (52/53),and 42.04% (66/157).The sensitivity of SAT-TB was higher than that of the smear test (3.50%,5/143) and modified Roche culture method (20.28%,29/143); the differences were statistically significant (χ2=19.08,P=0.021;χ2=9.12,P<0.01).The detection time of SAT-TB was one to two hours,while the modified Roche culture method needed six to eight weeks.ConclusionSAT-TB is a rapid method for detection ofMycobacteriumtuberculosisin pleural effusion,and its sensitivity is superior to the smear test and modified Roche culture method.

Pleural effusion;Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acid amplification techniques; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.019

252000 山東省聊城市傳染病醫(yī)院結(jié)核科(廖魯燕、楊國(guó)峰)；青島市胸科醫(yī)院外科(趙明偉)

趙明偉，Email：419790064@qq.com

2017-03-27)

李敬文)