王彬 付雷 徐建 郭少晨 朱慧 陸宇

·論著·

圣露丸的抗結(jié)核作用初步實驗研究

王彬 付雷 徐建 郭少晨 朱慧 陸宇

目的評價中藥圣露丸的體外及小鼠結(jié)核病模型中的抗結(jié)核活性。方法在7H9液體培養(yǎng)基、7H10固體培養(yǎng)基中分別測定圣露丸對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的最低抑菌濃度(MIC)。氣溶膠感染方式采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv先后感染SPF級BALB/C小鼠46只和36只，分別建立小鼠急性結(jié)核病模型。均為感染第10天開始給予藥物治療，隨機分組，每組10只。其中圣露丸組每只小鼠每次劑量為3 g/kg；異煙肼(INH)組，每次劑量為25 mg/kg，同時設(shè)無藥空白對照組。各組均口服灌胃給藥，每周給藥5次，分別給予3周和6周藥物治療。治療結(jié)束后次日處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數(shù)。結(jié)果圣露丸在7H9液體培養(yǎng)基中對H37Rv的MIC為2.5 mg/ml，在7H10固體培養(yǎng)基中對H37Rv的MIC為<5 mg/ml。小鼠感染及治療過程中各組耐受性良好，無死亡。給予3周共計15次(每次給予“圣露丸”3 g/kg)劑量治療后，圣露丸組小鼠全肺的CFU為 (6.81±0.71) lg CFU，較空白對照組降低0.39 lg CFU。應(yīng)用圣露丸治療6周后，圣露丸組的小鼠全肺的CFU為 (4.33±0.51) lg CFU，較空白對照組降低1.10 lg CFU。結(jié)論在本研究條件建立的小鼠結(jié)核病模型中，中藥圣露丸顯示出抗結(jié)核活性，值得進(jìn)一步研究。

分枝桿菌,結(jié)核； 中草藥； 治療結(jié)果； 對比研究； 圣露丸

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，隨著耐藥結(jié)核病患者的增加，現(xiàn)有抗結(jié)核藥物越來越無法滿足臨床治療的需求。新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)迫在眉睫，然而抗結(jié)核新藥研發(fā)周期長、難度大，自20世紀(jì)60年代利福平上市的50年來，僅2個具有全新結(jié)構(gòu)全新機制的抗耐藥結(jié)核病新藥分別于2012年、2014年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)有條件地上市。新藥研制艱難，對傳統(tǒng)中醫(yī)藥的研究成為解決結(jié)核病防治問題的重要途徑之一。

中醫(yī)藥是祖國的寶庫，中藥治療的優(yōu)勢是多成分、多靶點、多系統(tǒng)、低毒性地發(fā)揮綜合作用。中藥雖然不能治愈結(jié)核病，但在輔助治療、降低不良反應(yīng)發(fā)生及克服耐藥性等方面發(fā)揮重要作用，所以有必要對我國中醫(yī)藥進(jìn)行抗結(jié)核作用的評價，以發(fā)現(xiàn)其在抗結(jié)核治療中的作用和價值。本研究旨在通過體外測試及動物模型評價“圣露丸”的抗結(jié)核感染作用。

材料和方法

1.藥物:受試中藥“圣露丸”原粉由吉林省延邊神圣制藥有限公司提供，對照藥異煙肼(INH)為Sigma公司(美國)產(chǎn)品。

2.實驗菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存的菌株。

3.動物： SPF級雄性BALB/C小鼠，體質(zhì)量18～20 g/只，飼養(yǎng)在為感染動物模型設(shè)計的有空調(diào)的房間，每籠不超過6只小鼠，溫度在(21±2) ℃,濕度(55±15)%，保持12 h燈光/12 h黑暗的循環(huán)，動物可以方便地獲取食物和經(jīng)過濾的水。實驗開始前使動物適應(yīng)環(huán)境1周。實驗開始前獲得動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

4.最低抑菌濃度(MIC)的測定[1]：中藥圣露丸原粉和INH分別用蒸餾水溶解制成初溶液(儲備液)，滅菌后，使其在培養(yǎng)基中為所設(shè)計的以下濃度：中藥圣露丸終濃度為10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 mg/ml；INH終濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μg/ml。選取結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)2～3周的培養(yǎng)物制成菌懸液，接種到含0.05%吐溫-80、10%ADC(白蛋白、右旋糖、過氧化氫酶混合物)營養(yǎng)添加劑的7H9培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)1～2周，生長至濁度為McFarland 1[相當(dāng)于107菌落形成單位(CFU)/ml]時稀釋并分別接種到含藥的7H9液體培養(yǎng)基(含10%ADC)和7H10固體培養(yǎng)[含10%OADC(氯化鈉、牛血清白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶、油酸混和物)營養(yǎng)添加劑]中，菌液的終濃度為106CFU/ml。實驗分別設(shè)無藥對照，置37 ℃培養(yǎng)，以培養(yǎng)4周未見結(jié)核分枝桿菌生長的濃度為藥物的MIC。

5.小鼠藥物治療3周急性結(jié)核病模型的建立[2]：融化凍存的菌液，用含0.01%吐溫-80(在無菌條件下過濾除菌)的無熱原0.9% NaCl滅菌水稀釋至濃度為106CFU/mL，超聲波處理2 min以分散菌落?；罹嫈?shù)采用含10%OADC(美國BD公司,BBLTMMiddlebrook OADC Enrichment,Cat.No.212240)的Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基(美國BD公司,DifcoTMMiddlebrook 7H10 Agar Cat.No.262710)，接種系列稀釋度的菌液。按照氣溶膠感染裝置(099C A4224 Inhalation Exposure System)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染小鼠46只，感染劑量50～100 CFU/只。成功感染后第3、10天分別處死3只小鼠，做肺組織活菌計數(shù)。感染第10天開始給予藥物治療，采用數(shù)字表法隨機分為4組：(1)受試藥物組給予“圣露丸”3 g/kg(每天1次)(簡稱“圣露丸組”)；(2)陽性對照藥利福平(RFP，美國Sigma公司)組(簡稱“RFP組”)，給予RFP 10 mg/kg(每天1次)；(3)陽性對照藥異煙肼(INH，美國Sigma公司生產(chǎn))組(簡稱“INH組”)，給予25 mg/kg(每天1次)；(4)無藥空白對照組：每天給予0.5%羧甲基纖維素(CMC)。每組10只，各組均口服灌胃給藥，每周給藥5次，給藥3周共15次。給藥3周停藥，停藥后次日，處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數(shù)。

6.小鼠藥物治療6周急性結(jié)核病模型的建立：按照氣溶膠感染裝置(099C A4224 Inhalation Exposure System)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程感染36只小鼠結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，感染劑量50～100 CFU/只。感染后第3天、第10天分別處死3只小鼠，做肺組織活菌計數(shù)。感染第10天開始給予藥物治療：(1)圣露丸組每次給予“圣露丸”3 g/kg；(2)INH 組每次給予25 mg/kg；(3)無藥空白對照組每次給予0.5%CMC。每組10只，均口服灌胃給藥，每周給藥5次，給藥6周共30次。停藥次日處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數(shù)。

結(jié) 果

1.體外MIC結(jié)果：圣露丸在7H9液體培養(yǎng)基中，對H37Rv的MIC為2.5 mg/ml；在7H10固體培養(yǎng)基中，對H37Rv的MIC為<5 mg/ml。詳見表1。

表1 圣露丸與INH在不同培養(yǎng)基中對結(jié)核分枝桿菌H37Rv的MIC

2.小鼠急性結(jié)核病模型治療3周體質(zhì)量變化：小鼠在感染及治療整個期間一般狀況良好，無死亡。小鼠感染前的平均體質(zhì)量為(20.39±0.47) g，感染及治療過程中小鼠耐受性良好，無死亡。感染30 d即治療結(jié)束時，無藥空白對照組的平均體質(zhì)量為(27.76±1.80) g； INH組及RFP組的平均體質(zhì)量分別為(27.57±0.66) g、(27.83±1.10) g；圣露丸組的平均體質(zhì)量為(27.85±1.08) g。

3.小鼠急性結(jié)核病模型治療3周全肺活菌計數(shù)：感染的第3天，小鼠全肺活菌數(shù)為1.58 lg CFU，證明感染成功。感染第10天即治療當(dāng)日小鼠全肺活菌數(shù)為(2.90±0.39) lg CFU。治療結(jié)束時，解剖可見無藥空白對照組肺組織有較多的結(jié)核結(jié)節(jié)，病變較重； INH組及RFP組肺組織肉眼未見明顯結(jié)核結(jié)節(jié)；圣露丸組肺組織可見結(jié)核結(jié)節(jié)。無藥空白對照組小鼠全肺的活菌數(shù)為(7.12±0.28) lg CFU；INH組及 RFP組小鼠全肺的活菌數(shù)分別為(2.67±0.93) lg CFU和(6.31±0.07) lg CFU，較無藥空白對照組相比分別下降了4.45 lg CFU和0.81 lg CFU。圣露丸組小鼠全肺的活菌數(shù)為(6.81±0.71) lg CFU，較無藥空白對照組降低0.39 lg CFU。

4.小鼠急性結(jié)核病模型治療6周小鼠體質(zhì)量的變化：小鼠在感染及治療整個期間一般狀況良好，無死亡。小鼠感染前的平均體質(zhì)量為(19.48±0.37) g，感染60 d即治療結(jié)束時，無藥空白對照組的平均體質(zhì)量是(31.93±0.59) g，INH組為(31.37±0.96) g；圣露丸組為(30.44±1.40) g。

5．小鼠急性結(jié)核病模型治療6周小鼠全肺活菌計數(shù)：感染的第3天，小鼠全肺活菌數(shù)為(1.66±0.27) lg CFU，證明感染成功。感染第10天即治療當(dāng)日，小鼠全肺活菌數(shù)為(2.96±0.32) lg CFU。治療結(jié)束解剖時無藥空白對照組小鼠肺組織可見結(jié)核結(jié)節(jié)； INH組小鼠肺組織表面未見結(jié)節(jié)；圣露丸組小鼠肺組織可見結(jié)核結(jié)節(jié)。無藥空白對照組小鼠全肺的活菌數(shù)為(5.43±0.18) lg CFU；INH組小鼠全肺的活菌計數(shù)未見菌落生長；圣露丸組小鼠全肺的活菌數(shù)為 (4.33±0.51) lg CFU，較無藥對照組降低1.10 lg CFU。

討 論

結(jié)核病在中醫(yī)稱之為癆病，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病的產(chǎn)生有內(nèi)外兩方面因素，外因為感染癆蟲，內(nèi)因為正氣虛弱、氣血不足、陰精耗損所致。癆蟲是發(fā)病的因素，正氣虛弱是發(fā)病的基礎(chǔ)，體虛感染癆蟲是形成本病的關(guān)鍵[3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針對結(jié)核病產(chǎn)生的內(nèi)外因進(jìn)行治療具有獨特的優(yōu)勢，“一則補其虛，復(fù)其真元；一則殺其蟲，以絕其根本”[4]。

體外測定圣露丸對結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的MIC實驗結(jié)果顯示,圣露丸至少需要達(dá)到2.5 mg/ml 的濃度才能起到對結(jié)核分枝桿菌的抑制作用。因為圣露丸為復(fù)方制劑，組分較多，起到直接抑菌作用的成分未知，所以在體外抑菌實驗中需要的劑量較大。也說明中藥的殺菌能力較化學(xué)藥品差，效果較為緩慢。

小鼠急性結(jié)核病模型是模擬人體急性感染狀態(tài)，即人體免疫反應(yīng)未完全建立，結(jié)核分枝桿菌在肺組織中處于持續(xù)增殖狀態(tài)，評價的是藥物對結(jié)核分枝桿菌復(fù)制的抑制或直接殺滅作用。在小鼠急性感染結(jié)核病模型中，給藥15次后，圣露丸組較無藥空白對照組肺活菌數(shù)降低0.39 lg CFU，已經(jīng)表現(xiàn)出在活菌計數(shù)上的直接降低，說明圣露丸具有抗結(jié)核感染的作用。在此基礎(chǔ)上，筆者繼續(xù)應(yīng)用建立的小鼠急性結(jié)核病模型，給予更長時間的中藥治療。單獨應(yīng)用中藥圣露丸治療30次后，較無藥空白對照組肺活菌數(shù)降低1.1 lg CFU。肺活菌計數(shù)是動物模型中評價藥物活性最為客觀的指標(biāo)，此結(jié)果表明：在動物模型中單獨采用中藥圣露丸治療30次后表現(xiàn)出抗結(jié)核感染的活性。

中藥復(fù)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的組合，具有較為廣泛的作用位點，可以全面地調(diào)整機體狀態(tài)。中藥通過對多個系統(tǒng)及致病環(huán)節(jié)的聯(lián)合作用，達(dá)到治療疾病的目的。有研究結(jié)果表明，中藥抗癆主要通過增強機體免疫功能及在一定程度上抑制結(jié)核分枝桿菌的生長而達(dá)到治療的目的[5]。中藥配合西藥化療，不僅能促進(jìn)痰菌陰轉(zhuǎn)、空洞閉合、病灶吸收及縮短療程，而且有緩解抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)的作用，改善肺結(jié)核患者的臨床癥狀，進(jìn)而提高療效；同時可延緩耐藥性的產(chǎn)生[6-11]。圣露丸以益氣補血為基礎(chǔ)，健脾益氣的松花粉，補血的當(dāng)歸為本方主藥；其旨在氣血通暢，百病自去。從圣露丸的作用成分推測，其抗結(jié)核感染作用的發(fā)揮一方面具有一定的直接抗結(jié)核分枝桿菌的作用，另一方面具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。至于其如何發(fā)揮抗結(jié)核感染的機制還需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

中藥抗結(jié)核感染作用的體內(nèi)藥效學(xué)評價模型非常關(guān)鍵，目前多用化學(xué)藥物的評價方法；本研究主要以肺組織活菌數(shù)為評價指標(biāo)，表現(xiàn)出圣露丸具有一定的抗結(jié)核感染活性。當(dāng)然也有必要同時增加病理和免疫指標(biāo)以說明可能的作用機制，確定體內(nèi)抗結(jié)核分枝桿菌藥效學(xué)實驗的觀察指標(biāo)及制定中藥抗結(jié)核分枝桿菌藥效學(xué)實驗的標(biāo)準(zhǔn)方法十分必要[12]。

本研究結(jié)果顯示，中藥圣露丸具有一定的抗結(jié)核感染活性，值得進(jìn)一步研究，可試用于臨床輔助治療抗結(jié)核化療中產(chǎn)生嚴(yán)重肝、腎損傷的患者，以及無藥可治的復(fù)治結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病患者。

[1] 陸宇,鄭梅琴,王彬，等.氯法齊明抗結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)外活性研究.中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(10):752-755.

[2] Lu Y,Zheng M,Wang B,et al.Clofazimine analogs with efficacy against experimental tuberculosis and reduced potential for accumulation.Antimicrob Agents Chemother,2011,55(11):5185-5193.

[3] 趙霞，趙燁，朱國強．中藥在治療肺結(jié)核中的作用及地位．實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2005，19(6)：506-507．

[4] 劉秋瓊，高玉橋，林秋曉，等．中藥治療肺結(jié)核的研究進(jìn)展．中藥材，2007，30(11)：1478-1481．

[5] 凌彥博,梁艷,王小美,等.中藥復(fù)方牛貝消核提取物治療結(jié)核病相關(guān)靶標(biāo)的研究.中國防癆雜志，2016，38(1)：17-22.

[6] 姚嵐，范琳.肺泰膠囊輔助治療肺結(jié)核的研究進(jìn)展.中國防癆雜志,2016,38(1): 14-22.

[7] 劉曉，吳雪瓊.中藥治療耐多藥肺結(jié)核的研究進(jìn)展.中國防癆雜志,2016,38(1): 53-56.

[8] 方勇,肖和平,周勤琦,等.芪甲利肺膠囊輔助治療初治肺結(jié)核的回顧性分析研究.中國防癆雜志,2014,36(3): 184-188.

[9] 席秀娥,李明瑛,王霞,等.芪甲利肺膠囊輔助治療復(fù)治肺結(jié)核的療效及安全性觀察.中國防癆雜志,2014,36(11): 948-952.

[10] 聶琦，陶立軒，袁冶，等.百令膠囊輔助治療首次復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者的臨床研究.中國防癆雜志,2016,38(1): 61-63.

[11] 周穎，朱建民，周志英，等.中醫(yī)輔助治療對耐多藥肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫狀態(tài)改善的影響.中國防癆雜志,2016,38(1): 32-37.

[12] Liang Y,Wang X,Song J,et al.Therapeutic effects of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe in mouse tuberculosis models.J Ethnopharmacol,2017,195:318-323.

Preliminarystudyonanti-tuberculosisactivityofShengluwan

WANGBin,FULei,XUJian,GUOShao-chen,ZHUHui,LUYu.

BeijingKeyLaboratoryofDrugResistanceTuberculosisResearch,DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the anti-tuberculosis activity of traditional Chinese medicine named Shengluwan in vitro and in mouse tuberculosis model.MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) of Shengluwan againstMycobacteriumtuberculosisstandard strain H37Rv was determined by 7H9 liquid medium and 7H10 solid medium.A mouse tuberculosis acute model was set up through aerosol infection to SPF BALB/C mice usingMycobacteriumtuberculosisstandard strain H37Rv.On the 10th day of infection,drug treatments were begun with 3 g/kg of Shengluwan or 25 mg/kg of isoniazid,respectively.Ten mice in each group were orally administered by gavage for 3 weeks or 6 weeks treatments.At the end of treatment,the mice were sacrificed,weighed,sterilized under sterile operation and lungs CFU counted.The CFU between the groups were compared.ResultsThe MIC of Shengluwan against H37Rv was 2.5 mg/ml in 7H9 liquid medium,and less than 5 mg/ml in 7H10 solid medium.All mice were tolerant during the period of infection and treatment.There were no death mouse.After administration of 3 weeks,the CFU of the lungs in Shengluwan group were (6.81±0.71) lg CFU,which was 0.39 lg CFU lower than that of the control group.After 6 weeks treatment,the CFU of the whole lungs was (4.33±0.51) lg CFU in the Shengluwan group,which was 1.10 lg CFU lower than the control group.ConclusionIn the mice tuberculosis model,Shengluwan shows the anti-tuberculosis activity in mice.It is worth further study in the future.

Mycobacteriumtuberculosis; Drugs,chinese herbal; Treatment outcome; Comparative study; Shenglu wan

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.018

北京市醫(yī)院管理局“登峰”計劃專項經(jīng)費資助(DFL20151501)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

陸宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2017-08-25)

薛愛華)