陳素婷 黃明翔 胡嚴(yán)杰 尚媛媛 梁倩 付育紅 黃海榮

·論著·

熒光探針熔解曲線法檢測結(jié)核患者N-乙?；D(zhuǎn)移酶2基因型分布的應(yīng)用評價

陳素婷 黃明翔 胡嚴(yán)杰 尚媛媛 梁倩 付育紅 黃海榮

目的評價熒光探針熔解曲線法檢測結(jié)核病患者芳基胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(arylamineN-acetyltransferases 2，NAT2)基因多態(tài)性的性能。方法選取于2015—2016年到福州肺科醫(yī)院和北京胸科醫(yī)院確診的初治結(jié)核病患者作為研究對象，分別為371例和355例。收集研究對象外周血標(biāo)本。應(yīng)用熒光探針熔解曲線法[分析NAT2基因rs1801280(341T→G)、rs1799929(481C→T)、rs1799930(590G→A)和rs1799931(857G→A)等4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)]和DNA測序分析法[分析NAT2基因的rs1801279 (191G→A)、rs1041983 (282C→T)、rs1801280(341T→C)、rs1799929 (481C→T)、rs1799930 (590G→A)、rs1208 (803A→G)和1799931 (857G→A)的7個SNP位點]對研究對象進(jìn)行NAT2基因型分析，并根據(jù)NAT2基因型進(jìn)行NAT2代謝類型的推斷分析。結(jié)果熒光探針熔解曲線法分析4個SNP位點與DNA測序分析法分析7個SNP位點推斷NAT2代謝類型的結(jié)果完全一致。熒光探針熔解曲線法從DNA制備、PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析的整個檢測過程需要2.5 h。共檢測到NAT2 *4/*4、NAT2 *5/*4、NAT2 *6/*4、NAT2 *7/*4、NAT2 *5/*11、NAT2 *6/*11、NAT2 *7/*11、NAT2 *5/*6、NAT2 *6/*7、NAT2 *5/*5、NAT2 *6/*6、NAT2 *7/*7、NAT2 *5/*7等13種NAT2基因型。福州肺科醫(yī)院的結(jié)核病患者NAT2基因快乙?；⒅虚g乙?；吐阴；愋头謩e占37.20%(138/371)、42.32%(157/371)和20.49%(76/371)；北京胸科醫(yī)院的結(jié)核病患者中，快乙?；?、中間乙?；吐阴；愋头謩e占27.89%(99/355)、54.65%(194/355)、17.46%(62/355)；兩組人群的乙?；愋头植疾町愑薪y(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.37，P=0.003)。所有的快乙?；x人群均攜帶NAT2 *4/*4基因型[100.00%(237/237)]，而慢乙酰化代謝人群主要攜帶NAT2 *6和NAT2 *7的單倍型[90.22% (249/276)]。結(jié)論熒光探針熔解曲線法分析4個SNP位點檢測NAT2基因型具有結(jié)果判讀簡便、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點，適用于中國地區(qū)人群的NAT2基因型的檢測。

結(jié)核； 核酸探針； 芳基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶； 基因型； 多態(tài)性； 單核苷酸

芳基胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(arylamineN-acetyltransferases 2，NAT2)參與了多種藥物的代謝。NAT2基因的多態(tài)性影響了其編碼的芳基胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，與某些藥物在人體內(nèi)的代謝速度具有一定的關(guān)聯(lián)。依據(jù)NAT2酶代謝藥物的快慢情況，可以將人群分為NAT2快乙?；?、中間乙酰化和慢乙?；?種代謝類型。異煙肼作為最重要的一線抗結(jié)核藥物，在體內(nèi)可被芳基胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶代謝為乙酰異煙肼。研究表明，不同乙?；愋偷幕颊咴诜脴?biāo)準(zhǔn)劑量(5 mg/kg)異煙肼治療后，體內(nèi)的血藥濃度具有很大的差異[1-3]，具體表現(xiàn)為快乙酰化患者體內(nèi)異煙肼濃度低，不足以殺死結(jié)核分枝桿菌；慢乙?；颊哐帩舛雀撸赡軐?dǎo)致肝損傷等不良反應(yīng)[4]。因此，臨床治療時NAT2快乙?；颊呖赡苄枰m當(dāng)加大異煙肼的服用劑量，而慢乙?；颊邉t可能需要降低異煙肼的服用劑量。本研究利用熒光探針熔解曲線法和DNA測序的方法來檢測福建地區(qū)和北京地區(qū)結(jié)核病患者的NAT2基因型，了解不同地區(qū)結(jié)核病患者的NAT2基因多態(tài)性分布情況，同時評價基于熒光探針熔解曲線法的NAT2基因多態(tài)性檢測試劑盒的檢測性能。

材料和方法

1.研究對象：選取于2015—2016年到福州肺科醫(yī)院和北京胸科醫(yī)院就診并確診的初治結(jié)核病患者作為研究對象，分別為371例和355例。收集研究對象外周血標(biāo)本。所有研究對象的診斷均依據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[5]確診。本研究的樣品收集及研究方法均通過福州肺科醫(yī)院和北京胸科醫(yī)院倫理委員會的審批。

2.儀器和試劑：全血基因組提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物有限公司；NAT2基因多態(tài)性檢測試劑盒由廈門致善生物技術(shù)股份有限公司提供；PCR試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光PCR擴(kuò)增儀為羅氏熒光定量PCR LightCycler 480；核酸濃度和純度測定采用賽默飛Nanodrop 2000超微量分光光度計。

3.基因組DNA的提?。喊凑杖蚪M提取試劑盒的使用說明，進(jìn)行外周血基因組DNA的提取，測定DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。所提取的基因組DNA，將作為模板用于熒光探針熔解曲線分析和PCR-DNA測序。

4.熒光探針熔解曲線法檢測NAT2基因型：利用NAT2基因多態(tài)性檢測試劑盒進(jìn)行熒光探針熔解曲線法檢測。該試劑盒通過分析NAT2基因編碼區(qū)(870 bp)上，包括rs1801280(341T→G)、rs1799929(481C→T)、rs1799930(590G→A)和rs1799931(857G→A)的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的熔解曲線，來分析NAT2的基因型并推斷代謝類型，具體方法參考http://nat.mbg.duth.gr[6]。應(yīng)用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增體系(共25 μl)：19.6 μl的PCR混合物(含有引物和dNTP)，0.4 μl Taq (2 U)，5 μl的DNA模板。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，70 ℃退火15 s(每個循環(huán)降1 ℃，10個循環(huán)后降到60 ℃)，76 ℃延伸20 s，重復(fù)10個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，76 ℃延伸20 s，重復(fù)50個循環(huán)；熔解程序分3步：95 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性3 min，連續(xù)性分析45～85 ℃(0.03 ℃/s遞增)區(qū)間的熒光值變化。

5.NAT2基因的PCR擴(kuò)增及測序：PCR擴(kuò)增NAT2基因編碼區(qū)574～1641 bp區(qū)域，產(chǎn)物長度為1067 bp。PCR擴(kuò)增的引物序列分別為：上游引物5′-GGGCTGTTCCCTTTGAGA-3′和下游引物5′-TAGTGAGTTGGGTGATAC-3′，HiFi PCR混合物進(jìn)行序列擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，確定大小正確后，送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行核酸序列測定。通過分析NAT2基因的rs1801279 (191G→A)、rs1041983 (282C→T)、rs1801280(341T→C)、rs1799929 (481C→T)、rs1799930 (590G→A)、rs1208 (803A→G)和1799931 (857G→A)的7個SNP位點的突變情況，來推斷NAT2的基因型和代謝類型，具體方法參考http://nat.mbg.duth.gr[6]。

6.統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，研究對象年齡資料為偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(第25百分位數(shù)～第75百分位數(shù))”表示。采用卡方檢驗分析不同地區(qū)、性別結(jié)核病患者的NAT2基因型及代謝類型分布差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.基本情況：來自福州肺科醫(yī)院的研究對象中，男242例(65.23%)，女129例(34.77%)；年齡范圍為16～87歲，中位年齡43(29～58)歲。來自北京胸科醫(yī)院的研究對象中，男251例(70.70%)，女104例(29.30%)；年齡范圍為14～88歲，中位年齡41(25～55)歲。經(jīng)統(tǒng)計分析，來自福州肺科醫(yī)院和北京胸科醫(yī)院的患者性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.50，P=0.131)。

2.熒光探針熔解曲線法檢測NAT2基因型和表型的性能：通過與NAT2基因測序的7個SNP位點分析法進(jìn)行比較，熒光探針熔解曲線檢測NAT2基因4個SNP位點推斷NAT2代謝類型的結(jié)果與基因測序法的分析結(jié)果完全一致。熒光探針熔解曲線法從DNA制備、PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析的整個檢測過程需要2.5 h。

3.研究對象NAT2基因型和單倍型的分布特點：所有研究對象共檢測到13種NAT2基因型，分別為NAT2 *4/*4、NAT2 *5/*4、NAT2 *6/*4、NAT2 *7/*4、NAT2 *5/*11、NAT2 *6/*11、NAT2 *7/*11、NAT2 *5/*6、NAT2 *6/*7、NAT2 *5/*5、NAT2 *6/*6、NAT2 *7/*7和NAT2 *5/*7，見表1。與北京地區(qū)研究對象相比，福建地區(qū)結(jié)核病患者未檢測到NAT2 *5/*4、NAT2 *6/*11、NAT2 *7/*11和NAT2 *5/*6基因型。共有5種NAT2單倍型被檢出，分別為NAT2 *4[54.86%(796.5/1452)]、NAT2 *5[5.44%(79/1452)]、NAT2 *6[23.55%(342/1452)]、NAT2 *7[14.19%(206/1452)]和NAT2 *11[1.96%(28.5/1452)]。

4.研究對象NAT2代謝表型分布特點：通過NAT2基因型分析推斷的N-乙?；x表型的結(jié)果顯示，研究對象中NAT2代謝快乙?；⒅虚g乙?；吐阴；叻謩e占32.64%(237/726)、48.35%(351/726)和19.01%(138/726)，以中間乙?；癁橹鳌碜愿Ｖ莘慰漆t(yī)院的研究對象中，快乙?；⒅虚g乙?；吐阴；叻謩e占37.20%(138/371)、42.32%(157/371)和20.49%(76/371)；來自北京胸科醫(yī)院的研究對象中，快乙?；⒅虚g乙?；吐阴；叻謩e占27.89%(99/355)、54.65%(194/355)、17.46%(62/355)。兩組人群的NAT2基因代謝類型分布不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.37，P=0.003)，福州肺科醫(yī)院結(jié)核病患者中NAT2基因快乙酰化者所占比例明顯高于北京胸科醫(yī)院結(jié)核病患者。NAT2基因型分布情況見表1。所有快乙?；巳壕鶖y帶NAT2*4/*4基因型，而在慢乙酰化人群中攜帶NAT2 *6單倍型和NAT2 *7單倍型者最多，占所有慢乙?；騿伪缎偷?0.22%(249/276)，其余為NAT2 *5單倍型，占9.78%(27/276)。

NAT2基因型及表型的性別分布分析結(jié)果顯示，在所有男性患者中，快乙酰化型者占34.08%(168/493)，慢乙酰化型者占17.44%(86/493)；在所有女性患者中，快乙?；驼哒?9.61%(69/233)，慢乙酰化型者占22.32%(52/233)，從總體分布來看，性別與NAT2的代謝類型分布并無相關(guān)性(χ2=2.95，P=0.229)。

討 論

異煙肼的療效和不良反應(yīng)均與其使用過程中患者的血藥濃度相關(guān)。來自國內(nèi)外的多個研究發(fā)現(xiàn)，在排除了體質(zhì)量、年齡、性別等影響因素外，服用標(biāo)準(zhǔn)劑量(5 mg/kg)異煙肼治療的患者其血藥濃度存在非常大的差異(3～7倍)。20世紀(jì)60年代就有研究發(fā)現(xiàn)，受NAT2基因多態(tài)性影響的N-乙酰化水平與使用異煙肼治療患者的血藥濃度有著緊密的聯(lián)系[7]。針對東亞人群的研究顯示，NAT2慢乙?；巳喊l(fā)生異煙肼導(dǎo)致肝損傷的風(fēng)險明顯較一般人群高[2-3]。此外，許多臨床觀察性研究證實，NAT2基因型分析指導(dǎo)下的異煙肼用藥劑量調(diào)整，可以降低異煙肼導(dǎo)致的肝損傷或早期治療失敗的發(fā)生率[1-3]。

表1 NAT2代謝類型及基因型在不同來源地區(qū)結(jié)核病患者中的分布情況

注表中括號外數(shù)值為基因型頻次，括號內(nèi)數(shù)值為基因型頻率(%)

由于某些單倍型，如：NAT2 *12、NAT2 *13和NAT2 *14，在亞洲人群中十分罕見，通常認(rèn)為4個 SNP位點(341T→G,481C→T， 590G→A和857G→A)的分析就可滿足亞洲人群的檢測需要，特別是中國人群[8-9]。筆者應(yīng)用針對NAT2基因4個SNP位點的高分辨率熒光探針熔解曲線技術(shù)對北京地區(qū)和福建地區(qū)收集的初治結(jié)核病患者的血液樣本進(jìn)行檢測，共檢測出5個單倍型。其中，NAT2 *4、NAT2 *6和NAT2 *7 3個單倍型最為常見。本研究中，所有快乙?；巳壕鶠镹AT2 *4/*4基因型，而在慢乙酰化人群中NAT2 *6單倍型和NAT2 *7單倍型最為常見。北京地區(qū)結(jié)核病患者的NAT2基因型種類較福建地區(qū)結(jié)核病患者的NAT2基因型種類更為多樣化，推測可能與北京地區(qū)結(jié)核病患者來源地域更為廣泛有關(guān)。此外，本研究表明：基于熒光探針熔解曲線法的4個SNP位點分析結(jié)果和直接測序的7個SNP位點分析的結(jié)果完全一致；因此認(rèn)為，4個SNP位點的NAT2基因型分析可以有效地替代直接測序的7個SNP位點的基因型分析，而用于中國人群的NAT2基因型檢測。

在不同的人群中，NAT2基因多態(tài)性的分布具有高度多樣化。例如，西方人群NAT2慢乙?；巳旱谋嚷士梢愿哌_(dá)40%～70%[8,10]，而在中國和日本人群中則大致為15%～20%[11-13]。通過對北京地區(qū)和福建地區(qū)結(jié)核病患者的NAT2基因型分析，結(jié)果表明福建地區(qū)結(jié)核病患者中攜帶NAT2快乙?；吐阴；虻幕颊弑嚷瘦^北京地區(qū)更高，其中快乙?；颊叩谋嚷视绕涓摺５珡恼w來看，本研究分析的NAT2基因乙?；愋偷姆植记闆r與其他針對中國人群的NAT2基因型分析的研究結(jié)果相似[14]。大約有45%～60%結(jié)核病患者為NAT2慢乙酰化和快乙?；娜巳海枰M(jìn)行異煙肼用藥劑量的調(diào)整；一般認(rèn)為NAT2快乙?；颊呖赡苄枰m當(dāng)加大異煙肼的服用劑量，而慢乙?；颊邉t可能需要降低異煙肼的服用劑量[1-3]。因此，有必要對結(jié)核病患者進(jìn)行異煙肼用藥前的NAT2基因表型分析。

鑒于NAT2基因多態(tài)性和表型(N-乙酰化類型)之間存在直接的相關(guān)性，因此通過NAT2基因多態(tài)性的檢測就可以推斷個體對應(yīng)的N-乙酰化類型。目前，用來識別基因多態(tài)性的方法有很多，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高效液相色譜法(PCR-HPLC)、反向斑點雜交法和直接測序法等。盡管DNA測序仍是其他間接測序方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該方法相對復(fù)雜，需要昂貴的設(shè)備等，限制了其在臨床實驗室的應(yīng)用。而PCR-HPLC方法相對廉價且技術(shù)易于開展，但該方法的特異度和敏感度相對較低，不適合大規(guī)模樣本的檢測。筆者本次采用的熒光探針熔解曲線分析的方法，可在單一的反應(yīng)管中實現(xiàn)多個SNP位點的檢測，被證明是一種快速、可靠而有效的基因多態(tài)性檢測方法[15-17]。除了血液樣本，筆者在既往的研究中還評價了該試劑盒在唾液樣本中的檢測性能，表明其應(yīng)用于唾液樣本的檢測同樣具有良好的穩(wěn)定性[5]。由于熒光探針熔解曲線分析的檢測可在一個96孔板內(nèi)實現(xiàn)96份樣本的高通量檢測，并且包括DNA制備、PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析的整個檢測過程只需要2.5 h，因此，使得患者在異煙肼用藥前的NAT2基因型快速及高通量的檢測得以實現(xiàn)。

綜上所述，本研究證實針對4個SNP位點的熒光探針熔解曲線分析法可以在臨床實驗室中實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確且高通量地推斷結(jié)核病患者的NAT2代謝類型，為結(jié)核病患者的個體化治療提供了有利的手段，具有良好的臨床推廣應(yīng)用前景。

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TheevaluationoftheperformanceoffluorescenceprobemeltingcurveforNAT2genotypedetectionintuberculosispatients

CHENSu-ting*,HUANGMing-xiang,HUYan-jie,SHANGYuan-yuan,LIANGQian,FUYu-hong,HUANGHai-rong.

*NationalLaboratoryonClinicalTuberculosis,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorInstitute,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

ObjectiveTo evaluate the performance of fluorescent probe melting curve method for the detection of the gene polymorphism of arylamineN-acetyltransferases 2 (NAT2) in tuberculosis (TB) patients in China.MethodsFrom 2015 to 2016,the primary TB patients who visited Fuzhou Pulmonary Hospital of Fujian (n=371) or Beijing Chest Hospital (n=355) were selected.Peripheral blood samples of all patients were collected.NAT2 genotypes of all patients were analyzed by four-SNP genotype panels (rs1801280 (341T→G),rs1799929 (481C→T),rs1799930 (590G→A) and rs1799931 (857G→A)) using fluorescent probe melting curve method and seven-SNP genotype panels (rs1801279 (191G→A),rs1041983 (282C→T),rs1801280(341T→C),rs1799929 (481C→T),rs1799930 (590G→A),rs1208 (803A→G) and 1799931 (857G→A)) using DNA sequencing.The NAT2 acetylation phenotypes were deduced from theNAT2 genotypes.ResultsTheNAT2 acetylation phenotype for each individual inferred from four-SNP genotype panels using fluorescent probes melting curve method is consistent with that from seven-SNP genotype panels using DNA sequencing.The whole procedure of fluorescent probes melting curve method including DNA preparation,PCR amplification and melting curve analysis only took 2.5 hours.A total of 13 genotypes of NAT2 gene were detected as follow: NAT2 *4/*4,NAT2 *5/*4,NAT2 *6/*4,NAT2 *7/*4,NAT2 *5/*11,NAT2 *6/*11,NAT2 *7/*11,NAT2 *5/*6,NAT2 *6/*7,NAT2 *5/*5,NAT2 *6/*6,NAT2 *7/*7 and NAT2 *5/*7.TB patients from Fuzhou Pulmonary Hospital of Fujian with NAT2 rapid,intermediate or slow acetylators accounted for 37.20% (138/371),42.32% (157/371) and 20.49% (76/371),respectively,while patients with tuberculosis from Beijing Chest Hospital accounted for 27.89% (99/355),54.65% (194/355) and 17.46% (62/355),respectively.The distribution of NAT2 acetylation phenotypes of the above two groups was significantly different (χ2=11.37,P=0.003).All patients with NAT2 rapid acetylators carried NAT2 *4/NAT2 *4 genotype (100.00% (237/237)),and most of the patients with NAT2 slow acetylators carried NAT2 *6 and NAT2 *7 haplotype (90.22% (249/276)).ConclusionThe four-SNP genotype panels using fluorescent probe melting curve method is applicable forNAT2 genotyping in TB patients in China,with the advantage of easy to interpret result,fast and accurate.

Tuberculosis; Nucleic acid probes; ArylamineN-acetyltransferase; Genotype; Polymorphism; Single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.015

國家自然科學(xué)基金(31600107)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(2016-2-1041)；北京市優(yōu)秀人才項目(2015000021469G189)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室 國家結(jié)核病臨床實驗室 (陳素婷、胡嚴(yán)杰、尚媛媛、梁倩、付育紅、黃海榮)；福建省福州肺科醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)臨床教學(xué)醫(yī)院檢驗科(黃明翔)

黃海榮，Email：huanghairong@tb123.org

2017-04-18)

李敬文)