林明冠 吳元東 朱中元 林翀 陳灼霖 陳少文 蘇應(yīng)仙 陳偉彬 鐘業(yè)騰

·論著·

基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)中的效果分析

林明冠 吳元東 朱中元 林翀 陳灼霖 陳少文 蘇應(yīng)仙 陳偉彬 鐘業(yè)騰

目的比較基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥性中的應(yīng)用效果。方法選取2013年9月至2016年12月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院598例涂陽(yáng)肺結(jié)核住院患者的痰標(biāo)本，具有傳統(tǒng)藥敏結(jié)果和基因芯片結(jié)果的484例患者納入分析。采用基因芯片法檢測(cè)rpoB、katG及inhA基因耐藥突變位點(diǎn)及頻率，以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法的符合率。結(jié)果基因芯片和比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥性符合率為93.8%(454/484)，對(duì)異煙肼的耐藥性符合率為89.0%(431/484)，對(duì)耐多藥的符合率為95.5%(462/484)。118株檢測(cè)到rpoB基因發(fā)生突變，優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn)為531，占56.8%(67/118)；其次突變位點(diǎn)是526，占19.5%(23/118)；516突變位點(diǎn)占12.7%(15/118)。97株檢測(cè)到katG和inhA基因突變，最常見的突變位點(diǎn)是katG315，占82.5%(80/97)，inhA均為-15突變類型，占14.4%(14/97)。結(jié)論基因芯片法與比例法具有很好的一致性，可成為篩查結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼是否耐藥的快速有效的方法。

分枝桿菌，結(jié)核； 利福平； 異煙肼； 微生物敏感性試驗(yàn)； 寡核苷酸序列分析； 評(píng)價(jià)研究

結(jié)核病仍是全世界公共衛(wèi)生面臨的重大威脅[1]。2016年WHO全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2015年全球約有1040萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，其中新發(fā)耐多藥(同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥)結(jié)核病約48萬(wàn)例，有約45%的患者來(lái)自印度、中國(guó)和俄羅斯[2]。由于MTB生長(zhǎng)速度慢，傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)周期較長(zhǎng)，需4～8周才出結(jié)果，這不僅影響患者的早期診斷和治療，而且還加速了耐多藥結(jié)核病的傳播[3]。而基因芯片技術(shù)是一種通過檢測(cè)標(biāo)本中MTB的rpoB、katG和inhA基因的突變情況，從而判定其對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，具有快速、簡(jiǎn)便、高通量等特點(diǎn)，一次能夠同時(shí)檢測(cè)十幾至幾十個(gè)基因位點(diǎn)，適用于多位點(diǎn)分析[4]。目前，國(guó)內(nèi)外很多機(jī)構(gòu)已經(jīng)開展了基因芯片技術(shù)檢測(cè)MTB耐藥性的研究，但這些研究基本上是對(duì)MTB分離菌株進(jìn)行檢測(cè)；而在結(jié)核病防治工作中則是對(duì)患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，但國(guó)內(nèi)外較少有研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。筆者以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)海南地區(qū)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，對(duì)兩種檢測(cè)技術(shù)的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

資料和方法

一、資料

1.研究對(duì)象：選擇2013年9月至2016年12月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核住院患者598例納入觀察。每例患者留取清晨第一口痰標(biāo)本，每人2～3份痰標(biāo)本，每份標(biāo)本2～5 ml，經(jīng)檢測(cè)后，留取涂片陽(yáng)性級(jí)別較高的2份，各取1 ml混勻，同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)和基因芯片檢測(cè)。質(zhì)控菌株為H37Rv(ATCC27294)標(biāo)準(zhǔn)株，由國(guó)家結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室提供。

2.儀器與試劑：利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星和卡那霉素純藥粉由美國(guó)Sigma公司提供；改良羅氏培養(yǎng)基及含藥物的改良羅氏培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑均為北京博奧生物有限公司生產(chǎn)，包括ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slide WasherTM8芯片洗干儀、LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等；Life Express基因擴(kuò)增儀由杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。

二、方法

1.菌種初步鑒定：按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定要求處理MTB臨床分離株[5]，接種到酸性改良羅氏培養(yǎng)基上進(jìn)行MTB分離培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性菌株采用濃度為500 mg/L的對(duì)硝基苯甲酸(PNB)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群初步鑒定，在PNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的為非結(jié)核分枝桿菌，不生長(zhǎng)的即為MTB。

2.傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)：用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)制成1 mg/ml菌懸液，梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種到含利福平(40 mg/L)、異煙肼(0.2 mg/L)、鏈霉素(4 mg/L)、乙胺丁醇(2 mg/L)、左氧氟沙星(2 mg/L)和卡那霉素(30 mg/L)的藥敏培養(yǎng)基上，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果。含藥培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落≥不含藥培養(yǎng)基的1%，判定為耐藥；<不含藥培養(yǎng)基的1%，判定為敏感。

3.基因芯片法：將消化液(10 ml 2.94%檸檬酸三鈉、10 ml 4%氫氧化鈉、0.1 g N-乙酰-L-半胱氨酸)預(yù)處理好的痰標(biāo)本放入晶芯ExtractorTM核酸快速提取儀中提取核酸，將提取的核酸放入基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，將基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后加入到MTB耐藥檢測(cè)試劑盒的芯片點(diǎn)陣中，然后放入晶芯BioMixerTMⅡ雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)，再將完成雜交的芯片放入晶芯Slide WasherTM8芯片洗干儀中進(jìn)行洗干，將洗干的芯片載入晶芯LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀中，自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果判讀。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性用Kappa檢驗(yàn)判別(Kappa≥0.75，兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4，兩者一致性一般；Kappa<0.4，兩者一致性較差)。采用χ2檢驗(yàn)比較基因芯片法和傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、檢測(cè)一般情況

在598例培養(yǎng)的標(biāo)本中，有49例培養(yǎng)陰性(8.2%，49/598)，27例培養(yǎng)污染(4.5%，27/598)，在進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和菌種鑒定的522例分離株中，有25例鑒定結(jié)果為NTM(4.8%，25/522)，最后獲得可用于分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果者484例。在進(jìn)行芯片檢測(cè)的標(biāo)本中，未檢測(cè)到MTB者33例(5.5%，33/598)、NTM 25例(4.2%，25/598)，無(wú)法判讀結(jié)果3例(0.5%，3/598)，總計(jì)獲得可用于分析基因芯片結(jié)果者537例。綜合傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和基因芯片結(jié)果，總計(jì)有484例患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)利福平和異煙肼的藥物敏感性比較。

二、基因芯片與比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)利福平的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

基因芯片能夠同時(shí)完成MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測(cè)。對(duì)利福平的耐藥性檢測(cè)，基因芯片結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致率為93.8% (454/484)，敏感度為92.3% (96/104)，特異度為94.2% (358/380)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為81.4%(96/118)和98.4%(358/364)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)利福平耐藥率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=331.5，P<0.001)，Kappa值為0.825，兩種方法一致性較好(表1)。

三、基因芯片與比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)異煙肼的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于異煙肼的耐藥性檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=197.5,P<0.001)?；蛐酒瑱z測(cè)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率為89.0% (431/484)，基因芯片技術(shù)檢測(cè)的敏感度為77.5% (62/80)，特異度為91.3% (369/404)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為63.9%(62/97)和95.3%(369/387)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)對(duì)異煙肼的耐藥率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=197.5，P<0.001)，Kappa值為0.634，兩種方法一致性一般(表2)。

四、基因芯片與比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)結(jié)果

綜合基因芯片和比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)患者利福平和異煙肼檢測(cè)的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)了對(duì)耐多藥結(jié)核病的診斷效果，如表3所示。其中462例(95.5%,462/484)患者基因芯片檢測(cè)與比例法藥敏試驗(yàn)的診斷結(jié)果一致?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)的敏感度為69.6% (32/46)，特異度為98.2% (430/438)，基因芯片檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為80.0%(32/40)和96.8%(430/444)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)對(duì)耐多藥結(jié)核病的耐藥率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=251.9，P<0.001)，Kappa值為0.719，兩種方法一致性較好。

表1 基因芯片技術(shù)與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)菌株對(duì)利福平的耐藥結(jié)果比較

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 基因芯片技術(shù)與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)菌株對(duì)異煙肼的耐藥結(jié)果比較

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 基因芯片技術(shù)與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)菌株對(duì)耐多藥結(jié)核病的結(jié)果比較

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表4 基因芯片檢測(cè)118株突變型菌株rpoB、katG和inhA基因耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的分布

五、基因芯片對(duì)耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果

基因芯片檢測(cè)耐利福平基因時(shí)，野生型(即敏感)366株，突變型(即耐藥)118株，包括96株表型耐藥菌株和22株表型敏感菌株，其中112株存在單一位點(diǎn)突變，6株存在雙位點(diǎn)突變。rpoB突變頻率最高的位點(diǎn)是531，突變率是56.8%，其次是526位點(diǎn)，突變頻率是19.5%。基因芯片檢測(cè)耐異煙肼基因時(shí)，野生型387株，突變型97株，包括62株表型耐藥菌株和35株表型敏感菌株，其中80株是katG315位點(diǎn)的單一突變，突變率是82.5%，14株是inhA啟動(dòng)子區(qū)的突變，突變率是14.4%，katG的315位點(diǎn)和inhA的啟動(dòng)子區(qū)域存在雙突變的菌株有3株，占全部突變菌株的3.1%(表4)。

討 論

近年來(lái)，MTB耐藥性呈逐年上升趨勢(shì)，耐藥性問題已經(jīng)成為結(jié)核病控制的難題之一，因此結(jié)核病耐藥性檢測(cè)尤為重要[6]。而利福平和異煙肼作為最主要的一線抗結(jié)核藥物，其耐藥性檢測(cè)對(duì)于臨床選擇抗結(jié)核病藥物有重要意義[7]。WHO推薦使用的比例法藥敏試驗(yàn)穩(wěn)定性好，但需4周上的時(shí)間，無(wú)法為臨床提供及時(shí)的用藥參考。而基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢測(cè)耐藥基因的位點(diǎn)突變來(lái)預(yù)測(cè)表型耐藥，從而可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)MTB對(duì)藥物的耐藥性，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本研究利用基因芯片技術(shù)直接對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，通過檢測(cè)MTB的katG、inhA和rpoB基因突變對(duì)異煙肼和利福平的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。

本研究598例抗酸染色涂片陽(yáng)性的患者中，基因芯片法和培養(yǎng)法各檢出非結(jié)核分枝桿菌25例，符合率為100%；與李曉非等[8]報(bào)道的100%一致，與何莉等[9]報(bào)道的95.8%接近，說明基因芯片技術(shù)對(duì)結(jié)核病的確診有較大幫助。本研究進(jìn)一步比較了基因芯片和比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性差異，結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)MTB對(duì)利福平和異煙肼是否耐藥的結(jié)果一致率分別為93.8%和89.0%，敏感度為92.3%和77.5%，特異度為94.2%和91.3%。這與河南[10]、湖北[11]和河北[12]等地區(qū)報(bào)道的結(jié)果相似。根據(jù)Kappa值，基因芯片與比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)結(jié)果的一致性較好(Kappa=0.825)，對(duì)異煙肼耐藥性檢測(cè)結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.634)，與孫炳奇等[7]的研究結(jié)果一致；這可能是由于MTB對(duì)異煙肼耐藥基因的突變有多個(gè)基因位點(diǎn)，而基因芯片技術(shù)只檢測(cè)2個(gè)固定位點(diǎn)，可能導(dǎo)致其敏感度降低。而診斷耐多藥結(jié)核病的敏感度(69.6%)低于單耐利福平和單耐異煙肼的敏感度，特異度(98.2%)與單耐利福平和單耐異煙肼相似，符合率為95.5%。這與耿紅等[13]采用Meta分析表明的基因芯片對(duì)耐多藥結(jié)核病診斷的敏感度和特異度分別為75%和97%一致。這表明在實(shí)際應(yīng)用中基因芯片技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本的MTB耐藥檢測(cè)結(jié)果均具有較高的可靠性，其中是否對(duì)利福平耐藥的檢測(cè)可靠性高于是否對(duì)異煙肼耐藥的檢測(cè)可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，基因芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)利福平耐藥的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為81.4%和98.4%，檢測(cè)對(duì)異煙肼耐藥的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為63.9%和95.3%。張瑞梅等[14]研究發(fā)現(xiàn)，以痰標(biāo)本為檢測(cè)標(biāo)本，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，基因芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)利福平耐藥的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為71.4%和92.7%，檢測(cè)對(duì)異煙肼耐藥的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為54.5%和90.0%，與本研究結(jié)果相似。這表明基因芯片技術(shù)在臨床實(shí)際中有較好的應(yīng)用價(jià)值。

有學(xué)者研究表明，約有95%或更高比例的MTB對(duì)利福平耐藥與rpoB基因的507～533位密碼子的81 bp耐藥決定區(qū)突變有關(guān)，90%的點(diǎn)突變發(fā)生在該區(qū)域11個(gè)氨基酸密碼子之一的部位，其中最常見的突變位點(diǎn)是531位、526位和516位[15]。本研究中6個(gè)突變位點(diǎn)均位于利福平耐藥決定區(qū)域內(nèi)，而531、526和516位點(diǎn)突變者占總耐藥菌株的89.0%；其中531突變者占56.8%、526突變者占19.5%、516突變者占12.7%，這與之前北京[16]、河南[17]和武漢等[18]地區(qū)的研究結(jié)果相似，表明各地區(qū)之間MTB對(duì)利福平耐藥的rpoB基因突變位點(diǎn)和頻率區(qū)別不大。研究表明katG和inhA基因突變導(dǎo)致MTB對(duì)異煙肼耐藥，其中katG基因315密碼子的突變大約在50%～90%的異煙肼耐藥株中出現(xiàn)[15]。本研究顯示，82.5%的菌株在katG基因315位點(diǎn)有單一突變，是本地區(qū)最常見的對(duì)異煙肼耐藥的突變類型，略高于江西(65.8%)、上海(72.7%)和貴州(78.06%)，與福建(82.7%)相似，低于河北(89.9%)，這與之前研究表明katG基因315密碼子突變發(fā)生率有較大的地區(qū)差異一致[19]，這可能與不同地區(qū)的菌株來(lái)源及樣本量差異有關(guān)。此外，研究表明3%～30%的耐異煙肼菌株中存在inhA啟動(dòng)子區(qū)突變，最常見的突變類型是-15(C) C→T[15]。本研究結(jié)果顯示，14.4%的菌株在inhA基因15(C)位點(diǎn)有突變，這與其他研究結(jié)果相似[16-18]。

由于痰標(biāo)本中MTB的培養(yǎng)及其耐藥性檢測(cè)周期長(zhǎng)，而應(yīng)用基因芯片技術(shù)，只需1～2 d，將大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高自動(dòng)化程度，為患者的及時(shí)治療提供有利條件。本研究表明，基因芯片法可以快速檢測(cè)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，從而快速診斷耐多藥結(jié)核病，在耐藥結(jié)核病的臨床診斷和防治工作的實(shí)際應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，海南地區(qū)MTB對(duì)利福平和異煙肼耐藥以ropB基因531、526突變位點(diǎn)及katG315突變位點(diǎn)為主。

[1] L?nnroth K,Castro KG,Chakaya JM,et al.Tuberculosiscontrol and elimination 2010-50：cure,care,and social deve-lopment.Lancet,2010,375(9728): 1814-1829.

[2] World Health Organization.Global tuberculosis report 2016.Geneva：World Health Organization,2016.

[3] 石國(guó)民,喻容,彭雪峰,等.基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)及菌種鑒定中的應(yīng)用.中國(guó)防癆雜志,2015,37 (1): 66-73.

[4] Guo Y,Zhou Y,Wang C,et al.Rapidaccurate determination of multidrug resistance inM.tuberculosisisolates andsputum using a biochip system．Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(7): 914-920.

[5] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程.中國(guó)防癆雜志,1996,18(3): 127-134.

[6] 吳玉姣,朱珊梅,徐軍英,等.基因芯片與羅氏絕對(duì)濃度法對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)的效果比較.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,13(10): 1325-1327.

[7] 孫炳奇,張娟,孫嬌,等.基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥的臨床研究.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,18(3): 127-135.

[8] 李曉非,梁桂亮,普東,等.基因芯片技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定和結(jié)核耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用及評(píng)價(jià).中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015,19(2): 204-207.

[9] 何莉,任薇,梁雪妮,等.DNA芯片檢測(cè)分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(23): 10611-10613.

[10] 李衛(wèi)彬,李新旭,張彤群,等.基因芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼和利福平耐藥的實(shí)際應(yīng)用效果評(píng)價(jià).中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2012,6(16): 4666-4670.

[11] 胡曉紅,向啟云,莊倩,等.基因芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的可行性分析.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,12(23): 3421-3422.

[12] 張海英,高會(huì)霞,許怡,等.基因芯片方法快速檢測(cè)醞閱砸原栽月及利福平和異煙肼耐藥基因的研究.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,12(33): 1421-1424.

[13] 耿紅,李永文,李新旭,等.中國(guó)開展基因芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼和利福平耐藥性的Meta分析.中華傳染病雜志,2014,32(6): 357-363.

[14] 張瑞梅，劉成永，申濤，等.變色液體培養(yǎng)技術(shù)和基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥的方法比較及其臨床應(yīng)用.臨床肺科雜志,2009,14(3): 408-411.

[15] 張俊仙,吳雪瓊,陽(yáng)幼榮,等.應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼的耐藥性.中國(guó)防癆雜志,2011,33(10): 680-685.

[16] Mokrousov I,Jiao WW,Sun GZ,et al.Evaluation of therpoBmacroarray assay to detect rifampin resistanceMycobac-teriumtuberculosisin Beijing China．Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2006,25(11): 703-710.

[17] Zhang SL,Shen JG,Xu PH,et al.A noveI genotypic test forrapid detection of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates by a multiplex probe array.J Appl Microbiol,2007,103(4): 1262-1271.

[18] Deng JY,Zhang XE,Lu HB,et al.Multiplex dctcctlon ofmutations in clinical isolates of rifampin-resistantMycobacteriumtuberculosisby short oligonucleotide ligation assay on DNA chips.J Clin Microbiol,2004,42(10): 4850-4852.

[19] 戎奇吉,呂火祥,孫愛華.基因芯片快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌katG基因突變及其與異煙肼耐藥相關(guān)性.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011,27(3): 233-237.

EvaluationofGenechipforthedetectionofdrugresistanceofMycobacteriumtuberculosis

LINMing-guan*,WUYuan-dong,ZHUZhong-yuan,LINChong,CHENZhuo-lin,CHENShao-wen,SUYing-xian,CHENWei-bin,ZHONGYe-teng.

*DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570311,China

ZHONGYe-teng,Email:zhongyeteng@163.com

ObjectiveTo compare Genechip and the proportion method drug susceptibility test in detectingMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin and isoniazid.MethodsA total of 598 sputum specimens of sputum smear-positive pulmonary tuberculosis inpatient cases from the Affiliated Hospital of Hainan Medical College between September 2013 and December 2016.Finally,484 patients with the results of both traditional drug susceptibility test and Genechip were included.Genechip was used to detect the mutations and frequencies ofrpoB,katGandinhA.The proportion method drug susceptibility test was used as the gold standard to evaluate the overall concordance.ResultsCompared with the proportion method drug susceptibility test,the coincidence rate ofMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin and isoniazid detected by Genechip was 93.8% (454/484) and 89.0% (431/484),respectively,and that to multi-drug resistance was 95.5% (462/484).TherpoBmutations were detected in 118 strains,of which 56.8% (67/118) carried mutations at codon 531,19.5% (23/118) at codon 526,12.7% (15/118) at codon 516.Of all the 97 strains withkatGandinhAmutations,the predominant mutation site ofkatGwas codon 315 with the mutation rate of 82.5% (80/97),and 14.4% (14/97) carried mutations atinhA-15 (C→T).ConclusionThe results of Genechip method were highly consistent with that of proportion method drug susceptibility test,and Genechip was a fast and effective method for screening for rifampin and isoniazid againstMycobacteriumtuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; Rifampin; Isoniazid; Microbial sensitivity tests; Oligonucletide array sequence analysis; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.014

570311 ?？冢Ｄ厢t(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(林明冠、朱中元、林翀、陳灼霖、陳少文、蘇應(yīng)仙、陳偉彬、鐘業(yè)騰)；海南省儋州市疾病預(yù)防控制中心(吳元東)

鐘業(yè)騰，Email: zhongyeteng@163.com

注：林明冠和吳元東對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者

2017-07-14)

范永德)