龔理杰 呂佳 徐繼 錢振淵 葉再元?

miRNA-744-5p靶向TGFβ-1抑制胃癌侵襲遷移的機(jī)制研究

龔理杰 呂佳 徐繼 錢振淵 葉再元?

目的 檢測胃癌組織中和人胃癌細(xì)胞株中miRNA-744-5p的表達(dá)情況，并通過改變胃癌細(xì)胞株中miRNA-744-5p的表達(dá)，觀察人胃癌細(xì)胞株侵襲、遷移能力的變化并探討生物學(xué)機(jī)制。方法 通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測37例胃癌患者的胃癌組織及其配對的癌旁組織中miRNA-744-5p的表達(dá)水平，并對胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株中的miRNA-744-5p表達(dá)水平進(jìn)行檢測。在胃癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-744-5p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）以上調(diào)、下調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)，通過Transwell試驗(yàn)檢測其對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。將通過生物信息學(xué)軟件篩選的miRNA-744-5p潛在的靶基因進(jìn)行雙熒光素酶試驗(yàn)及Western blot 試驗(yàn)驗(yàn)證，并探討其促轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。結(jié)果 胃癌組織、胃癌細(xì)胞株的miRNA-744-5p表達(dá)水平較正常胃黏膜組織、正常胃黏膜上皮細(xì)胞株均顯著降低（P＜0.05）。分別上調(diào)、下調(diào)胃癌細(xì)胞中miRNA-744-5p的表達(dá)水平，能夠抑制、促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。miRNA-744-5p與TGFβ-1間存在反向調(diào)控的關(guān)系，TGFβ-1是miRNA-744-5p的靶基因。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，下調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)時，TGFβ-1表達(dá)上調(diào)，而當(dāng)上調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)時，TGFβ-1表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 在胃癌組織中miRNA-744-5p 的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致TGFβ-1在胃癌組織中的高表達(dá)以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移。

胃癌 miRNA-744-5p TGFβ-1 侵襲 遷移

Objective To detect the miR-744-5p expression level in gastric cancer（GC）tissue and cells，and to observe the effects of invasion and migration on the gastric cancer cell due to the changes of miRNA expression. To explore the biological function of miR-744-5p in GC.Methods The miR-744-5p expression level was detected in 37 paired GC tissues and normal gastric mucosal tissues by real-time PCR. The expression levels of miR-744-5p in fi ve GC cell lines and the normal gastric mucosal cell（GES-1）were detected similarly. SGC-7901 which with the highest expression level were transected with miR-744-5p inhibitor，and AGS which with the lowest expression level were transected with miR-744-5p mimics.Then they were selected to use for the invasion and migration tests. TGFβ-1 was predicted as a target gene of miR-744-5p by screening of the miRBase Targets，TargetScan Release 5.0 and PicTar databases and identif i ed by the luciferase reporter assay and Western Blot. Results The expression levels of miR-744-5p were lower in GC tissues and cells than in their pair-matched adjacent normal tissues and normal gastric mucosal cell. Up-regulation and down-regulation the expression of miR-744-5p levels could restrain and promote GC cells invasion and migration ability. TGFβ-1 expression was inversely correlated with miR-186-3p expression in GC. TGFβ-1 is one of target gene of miR-744-5p. Conclusions MiR-744-5p is down-regulated in GC tissues and cell lines and associates with the metastasis of GC cell by targeting TGFβ-1.

Gastric cancer MiRNA-744-5p TGFβ-1 Invasion Migration

在我國，胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤死亡第2位［1］。根治性手術(shù)聯(lián)合化療仍然是胃癌患者的首選治療方案［2］。然而較多胃癌患者確診時已屬中晚期，即使進(jìn)行根治手術(shù)聯(lián)合化療其5年生存率仍＜20%［3］。成熟微小RNA（miRNAs）是一段長度在18～25nt的非編碼RNA核苷酸序列，其通過與靶基因的3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，從而影響mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制蛋白質(zhì)翻譯［4］。研究表明，miRNA的異常表達(dá)可能會抑制腫瘤生成，也可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［5］。其中miR-744-5p是新近發(fā)現(xiàn)的一個在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用的微小RNA，本文初步探索miR-744-5p在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，MKN-45，MKN-28，AGS，BGC-823和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1均購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)均用含有10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）和抗生素（100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素）的1640培養(yǎng)基（美國Hyclon公司），并置于37℃含有5%的培養(yǎng)箱中。貼壁細(xì)胞傳代時用0.02% EDTA/0.25%胰蛋白酶消化3～5min。

1.2 臨床標(biāo)本 37例新鮮胃癌組織標(biāo)本及配對癌旁組織均取自2014年1月至12月浙江省人民醫(yī)院診斷為胃癌并手術(shù)切除的患者（年齡41～74歲，男21例，女16例），術(shù)前均未行化療，并冷藏于-80℃冰箱。所有患者均知情并簽署同意書，本項(xiàng)目經(jīng)浙江省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 RNA提取，cDNA合成和熒光定量PCR 細(xì)胞和新鮮組織標(biāo)本RNA提取參照Trizol試劑盒使 用 說 明（Thermo Fisher Scientific），cDNA 的合 成 采 用the Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit（TaKaRa），miRNA的表達(dá)水平檢測采用SYBR green法（TaKaRa）。內(nèi)參RNU6b的特定正向引物為 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miRNA-744-5p的特定引物為5'-ACACTCCAGCTGGGT GCGGGGCTAGGGCTAAC-3'。PCR反應(yīng)體系是：95℃預(yù)熱 5min，95℃ 10s，60℃ 10s 、72℃ 10s共 40個循環(huán)。結(jié)束后分析其熔化曲線。組織樣本及細(xì)胞株中miRNA-744-5p相對于內(nèi)參RNU6B的相對表達(dá)水平采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行比較。

1.4 轉(zhuǎn)染 將胃癌細(xì)胞株在六孔板中培養(yǎng)，鋪板濃度2.0×105/每孔，24h后將miR-744-5p表達(dá)相對較高的SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-744-5p抑制劑（銳步生物醫(yī)藥），將miR-744-5p表達(dá)相對較低的AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-744-5p模擬物（銳步生物醫(yī)藥），模擬物對照組和抑制劑對照組采取平行設(shè)置。轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 3000試劑盒（Qiagen公司）步驟并按其說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染24h后的胃癌細(xì)胞。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)采用 Costar Transwell 試劑盒（康寧公司），侵襲實(shí)驗(yàn)采用含有人工基底膜板的侵襲小室（康寧公司），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（侵襲實(shí)驗(yàn)用1.5×105個細(xì)胞，遷移實(shí)驗(yàn)用8.0×104個細(xì)胞）用無血清培養(yǎng)基重懸后被放入Transwell小室上室中，下室中加入30%胚牛血清，遷移實(shí)驗(yàn)在37℃ 5% CO2環(huán)境中孵育24h，侵襲實(shí)驗(yàn)在37℃ 5%CO2環(huán)境中孵育48h。隨后將Transwell膜用無水酒精固定，上表面非侵入性的細(xì)胞用棉簽擦去，然后經(jīng)蘇木精和伊紅染色，最后在高倍顯微鏡下拍攝穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.6 熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)和目標(biāo)基因識別 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA-744-5p的靶基因TGFβ-1，確定miRNA-744-5p與靶基因TGFβ-1的作用位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并分以下3組：NC組：共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget報告質(zhì)粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細(xì)胞。TGFβ-1-野生組：共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget-TGFβ-1-3U報告質(zhì)粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細(xì)胞。TGFβ-1-突變組：共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget-TGFβ-1-3U-D報告質(zhì)粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細(xì)胞。螢火蟲熒光素酶反應(yīng)：在熒光發(fā)光計的試管中先后加入100μl的LARII試劑和20μl PLB裂解液，混勻，產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，置入檢測儀測量發(fā)光值。海參熒光素酶反應(yīng)：同一樣品中加入100μl Stop&Glo試劑，停止上述反應(yīng)，同時啟動海參熒光素酶反應(yīng)，置入檢測儀檢測發(fā)光值。對每個轉(zhuǎn)染組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性檢測，所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三個復(fù)孔。

1.7 蛋白質(zhì)印記分析 分別收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，經(jīng)過水洗、裂解后溶于RIPA緩沖液中，并用蛋白濃度測定試劑盒（Thermo公司）測定蛋白質(zhì)濃度，檢測采用BCA（bicinchoninic acid）法。將等效量（30～50μg）的蛋白質(zhì)在10% SDS-PAGE膠中電泳分離，再轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（Millipore公司）。PVDF膜經(jīng)含5%的脫脂奶粉Tris-緩沖液中封閉2h，再加入TGFβ-1（proteintech公司）一抗，在4℃的環(huán)境下振蕩孵育過夜。將孵育過夜的膜用TBST清洗3次后放入含辣根過氧化物酶和1：1000稀釋的二抗中孵育1h，TBST洗滌3次，加入ECL試劑（三一重工），利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，Bio-rad）檢測Western blot條帶信號。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟。檢測miR-744-5p的熒光定量PCR表達(dá)水平和熒光素酶相對活性采用（x±s）表示。正態(tài)分布結(jié)果通過配對樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，非正態(tài)分布結(jié)果且比較多個相關(guān)組樣本時，采用Wilcoxon檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-744-5p在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平 miRNA-744-5p在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯低于在正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平［（0.336±0.028）vs（0.179±0.025），P＜0.05］；miRNA-744-5p在胃癌細(xì)胞株 BGC-823、MKN-45、7901、MKN-28、AGS 中的表達(dá)水平均低于在正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)水平（P＜0.05），且不同胃癌細(xì)胞株間兩兩比較，miRNA-744-5p在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中相對高表達(dá)（P＜0.05），而在胃癌細(xì)胞株AGS中相對低表達(dá)（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miRNA-744-5p在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

2.2 miRNA-744-5p對胃癌SGC-7901、AGS細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 與陰性對照組比較，胃癌SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-744 inhibitor 后侵襲、遷移能力均顯著增強(qiáng)；胃癌AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-744 mimics 后侵襲、遷移能力均顯著減弱。見圖2。

2.3 miRNA-744-5p靶基因預(yù)測與驗(yàn)證 生物信息學(xué)軟件預(yù)測到在TGFβ-1的3'-UTR 區(qū)有1 個miRNA-744-5p的結(jié)合位點(diǎn)。Western blot結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中上調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)能夠顯著抑制TGFβ-1的表達(dá)（P＜0.05），當(dāng)抑制miRNA-744-5p的表達(dá)時可上調(diào)的TGFβ-1（P＜0.05）。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)T 組中的熒光素酶活性明顯低于NC組（P＜0.05）；而MUT組的熒光素酶活值與NC 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。同時Western blot結(jié)果顯示，在胃癌7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-744 inhibitor 下調(diào)miRNA-744表達(dá)后，TGFβ-1的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。與此相反，在胃癌AGS細(xì)胞中上調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)，TGFβ-1的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，miRNA-744在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，如宮頸癌、鼻咽癌、肝癌和胰腺癌等惡性腫瘤。在宮頸癌中，miRNA-744通過靶向調(diào)節(jié)Bcl-2影響腫瘤細(xì)胞的凋亡能力抑制宮頸癌的增長和進(jìn)展［6］。在鼻咽癌中，miR-744作為原癌基因通過靶向調(diào)控ARHGAP5基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與進(jìn)展［7］。在肝癌細(xì)胞中miR-744的低表達(dá)與其肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)［8］。雖然，miRNA-744在大多數(shù)腫瘤中低表達(dá)，呈現(xiàn)出抑癌基因的功能，但也有相關(guān)研究報道，miRNA-744在腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，發(fā)揮致癌作用，如在胰腺癌中，miRNA-744通過抑制抑SFRP1，GSK3β和TLE3的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路，以此促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［9］。而miR-744-5p在胃癌中的作用卻鮮有研究。本資料顯示，與在正常胃黏膜組織中相比，miRNA-744-5p在胃癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)；下調(diào)miRNA-744-5p的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，而上調(diào)其表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。提示miRNA-744-5p在胃癌中呈現(xiàn)抑癌基因的功能。通過生物信息數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)TGFβ-1可能為miRNA-744-5p的1個靶基因。TGFβ-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族中的一員［10］。其參與執(zhí)行較多細(xì)胞功能，包括控制細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡［11］。在一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展當(dāng)中，TGF-β1也起到重要作用。如在乳腺癌中TGFβ-1表現(xiàn)出兩面性，在腫瘤早期可抑制腫瘤生長及影響細(xì)胞凋亡，在腫瘤晚期其又轉(zhuǎn)而成為腫瘤促進(jìn)因子［12］。在膀胱癌中，通過STMN1基因調(diào)節(jié)TGFβ-1的表達(dá)從而促進(jìn)膀胱癌侵襲、遷移的能力［13］。研究表明，TGF-β1可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞間的粘附力并增強(qiáng)其侵襲能力［14］。有文獻(xiàn)報道，miR-744-5p可能參與TGFβ-1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，存在靶向關(guān)系［15］。本資料結(jié)果顯示相對于陰性對照組，高表達(dá)miR-744-5p組的熒光素酶活性明顯降低；且對于TGFβ-1 3'末端有突變的實(shí)驗(yàn)組，miR-744-5p并不能改變其熒光素酶活性。采用免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-744-5p與TGFβ-1間存在反向調(diào)控的關(guān)系，因此作者認(rèn)為TGFβ-1可能是miR-744-5p下游的靶向調(diào)控位點(diǎn)。

綜上所述，miR-744-5p在胃癌組織細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且高表達(dá)miR-744-5p可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，而miR-744-5p在胃癌細(xì)胞中的抑癌作用可能是通過靶向調(diào)控TGFβ-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項(xiàng)目（2017KYB018）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（龔理杰 呂佳）

310014 浙江省人民醫(yī)院（徐繼 錢振淵 葉再元）

*通信作者