馮麗娟，張素平，劉博會，李福滔，王慕真，何 銳，鄧婉青

（暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

PGE1對改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路的作用研究

馮麗娟，張素平，劉博會，李福滔，王慕真，何 銳，鄧婉青

（暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

目的：探討前列腺素E1（PGE1）對血管性癡呆（VD）大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路在其中的作用。方法：將48只成年雄性大鼠分為假手術(shù)組、鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組，每組各有12只大鼠。使用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法將鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組大鼠制成慢性腦低灌注誘導(dǎo)的VD大鼠模型，對假手術(shù)組大鼠的頸動脈進(jìn)行鈍性分離，并使用4-0號縫線對其頸動脈進(jìn)行環(huán)繞，但不進(jìn)行結(jié)扎。4周后，為假手術(shù)組和鹽水組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射生理鹽水，為PGE1組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射PGE1。為PGE1+K252a組大鼠經(jīng)右側(cè)腦室注射TrkB拮抗劑——K252a和DMSO（二甲基亞砜）后，為該組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射PGE1。對四組大鼠進(jìn)行水迷宮實驗和條件性恐懼實驗，比較其進(jìn)行這兩種實驗的結(jié)果。在光學(xué)顯微鏡下觀察四組大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細(xì)胞的排列情況。結(jié)果：在這四組大鼠中，假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期最短，鹽水組大鼠的逃避潛伏期最長（P＜0.05）。PGE1組大鼠的逃避潛伏期短于PGE1+K252a組大鼠（P＜0.05）。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與鹽水組和PGE1+K252a組大鼠相比，PGE1組和假手術(shù)組大鼠跨越原平臺的次數(shù)較多（P＜0.05）。PGE1組大鼠跨越原平臺的次數(shù)多于假手術(shù)組大鼠（P＜0.05）。假手術(shù)組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比均大于鹽水組和PGE1+K252a組大鼠(P＜0.05）。假手術(shù)組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列緊密、均勻。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列松散。PGE1組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列緊密、均勻，可見少許的脫落細(xì)胞。結(jié)論：PGE1可有效地改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。此作用是通過調(diào)節(jié)VD大鼠體內(nèi)BDNF/TrkB信號通路來實現(xiàn)的。

前列腺素E1；血管性癡呆；BDNF/TrkB信號通路

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）多繼發(fā)于腦動脈粥樣硬化、腦卒中等腦血管疾病。此病是一種智能障礙綜合征[1-2]。VD患者的記憶和認(rèn)知功能可出現(xiàn)障礙。前列腺素E1(prostaglandinE1，PGE1)具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血管再生、抗血小板聚集、抗炎等多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。此藥被廣泛地應(yīng)用于對心腦血管疾病患者進(jìn)行治療的過程中。有動物實驗表明，PGE1可有效地促進(jìn)VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)血管的再生，進(jìn)而改善其認(rèn)知功能。研究發(fā)現(xiàn)，PGE1的這一作用機(jī)制可能與BDNF/TrkB信號通路有關(guān)[4-5]。為了探討PGE1對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及BDNF/TrkB信號通路在其中的作用，筆者進(jìn)行了研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

取48只成年雄性大鼠（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2013-0001），其體重為200～250 g。將這些大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組，每組各有12只大鼠。

1.2 造模的方法

使用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法使鹽水組、PGE1組和PGE1+K252a組大鼠成為VD大鼠模型[6]。對假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的頸動脈鈍性分離操作，并使用4-0號縫線對其頸動脈進(jìn)行環(huán)繞，但不對其頸動脈進(jìn)行結(jié)扎。

1.3 給藥的方法

在造模4周后，為假手術(shù)組和鹽水組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射1 ml的生理鹽水。按照10 ug/kg的劑量取適量的PGE1，將其加入到1 ml的生理鹽水中為PGE1組和PGE1+K252a組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射。在為PGE1+K252a組大鼠注射PGE1的前30 min，按照10μg/kg的比例取適量的含有K252a和DMSO的溶液對大鼠進(jìn)行注射，注射的部位為右側(cè)腦室，注射的速度為2 ul/min。四組大鼠均連續(xù)注射7 d。

1.4 進(jìn)行水迷宮實驗（MorrisWaterMaze，MWM）的方法

在進(jìn)行藥物處理的第2 d，對四組大鼠均進(jìn)行水迷宮實驗[7]。在進(jìn)行水迷宮實驗時使用的水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)是由一個圓形水池、懸掛在水池正上方的攝像機(jī)、與攝像機(jī)相連的計算機(jī)三部分組成。水池的直徑約為120 cm，其深度約為50 cm。水池被周圍標(biāo)著東、南、西、北四個方位的標(biāo)志牌平分為四個象限。將站臺置于第三象限的中間，站臺的高度約為30 cm，其直徑約為9 cm，水面超過站臺2～3 cm。用攝像機(jī)跟蹤大鼠在水池中的運動軌跡并記錄相關(guān)的時間。進(jìn)行水迷宮實驗的時間為6 d。水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。在第1～第5 d，對四組大鼠均進(jìn)行定位航行實驗。進(jìn)行定位航行實驗的方法是：每天將大鼠的頭朝池壁從四個象限依次放入水池中，進(jìn)行四次定位航行實驗的平均潛伏期即為該只大鼠當(dāng)天的成績。每次進(jìn)行定位航行實驗的時間為120 s，進(jìn)行兩次定位航行實驗的間隔時間為20 min。記錄每只大鼠每次進(jìn)行定位航行實驗的逃避潛伏期。逃避潛伏期是指從大鼠被放入水池中直至其爬到平臺上的這段時間。逃避潛伏期反映了大鼠的學(xué)習(xí)能力。逃避潛伏期越短，說明大鼠的學(xué)習(xí)能力越好。大鼠若超過120 s仍未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺，使其熟悉平臺周圍的環(huán)境，并將其游泳的用時記為120 s。定位航行實驗結(jié)束后，記錄在這5 d內(nèi)大鼠的平均逃避潛伏期。在第6 d，撤去平臺，在原平臺所在象限的對側(cè)將大鼠頭朝池壁放入水池中，每只大鼠進(jìn)行1次空間探索實驗，將進(jìn)行空間探索實驗的時間設(shè)置為120 s。將大鼠跨越原平臺的次數(shù)作為其進(jìn)行空間探索實驗的成績。用跨越原平臺的次數(shù)評估大鼠對空間的記憶能力。大鼠跨越原平臺的次數(shù)越多，說明其對空間的記憶力越好。

1.5 進(jìn)行條件性恐懼實驗（ContextualandCuedFearConditio ning）的方法

水迷宮實驗結(jié)束后，對四組大鼠均進(jìn)行為期2 d的條件性恐懼實驗[8]。在進(jìn)行條件性恐懼實驗的第1 d，將大鼠放到條件恐懼箱中，讓其在條件恐懼箱中自由探索2 min。通過震驚反射系統(tǒng)和計算機(jī)控制、記錄在這2 min內(nèi)大鼠發(fā)生震驚反射的時間，以評估大鼠對恐懼的記憶能力。震驚反射是指大鼠除了呼吸以外沒有其他任何活動。然后，對大鼠進(jìn)行30 s的聲音刺激，聲音的響度為90 db。在進(jìn)行聲音刺激的最后2 s時，對大鼠進(jìn)行電擊，電流為4 mA。讓大鼠在條件恐懼箱中休息90 s，對其進(jìn)行聲音刺激（時間為30 s，聲音的響度為90 dB）和電擊（電流為4 mA，時間為2 s）。最后，讓大鼠休息90 s，將其從條件恐懼箱中取出。在第2 d，將大鼠放到與第1 d相同的條件恐懼箱中，讓其自由探索3 min后將其取出，記錄大鼠在這期間發(fā)生震驚反射的時間。最后，計算大鼠在進(jìn)行環(huán)境及聲音刺激實驗中發(fā)生震驚反射時間的百分比。發(fā)生震驚反射時間的百分比=發(fā)生震驚反射的時間/進(jìn)行環(huán)境或聲音刺激實驗的時間×100%。大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比越大，說明其對恐懼的記憶力越好。

1.6 用光鏡觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列情況的方法

條件性恐懼實驗結(jié)束后，對四組大鼠均進(jìn)行麻醉，經(jīng)灌注后快速取腦。將獲取的腦組織放到4℃濃度為4%的多聚甲醛固定液中固定。在第2 d，將四組大鼠的腦組織分別放到4℃濃度為10%、20%、30%的蔗糖溶液中依次進(jìn)行脫水處理。然后將大鼠腦組織制作成冰凍切片。對冰凍切片進(jìn)行HE染色后，在光鏡下觀察切片中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的排列情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對四組大鼠進(jìn)行水迷宮實驗結(jié)果的比較

進(jìn)行定位航行實驗的結(jié)果顯示，假手術(shù)組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組大鼠的逃避潛伏期分別為（28.5±26.5）s、（39.2±27.9）s、（30.9±25.4）s、（37.8±25.2）s。在這四組大鼠中，假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期最短，鹽水組大鼠的逃避潛伏期最長（P＜0.05）。PGE1組大鼠的逃避潛伏期短于PGE1+K252a組大鼠（P＜0.05）。詳見圖1。進(jìn)行空間探索實驗的結(jié)果顯示，假手術(shù)組、鹽水組、PGE1組、PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數(shù)分別為（4.33±1.23）次、（3.83±1.27）次、（5.93±1.03）次、（3.64±1.29）次。在這四組大鼠中，鹽水組和PGE1+K252a組大鼠跨越原平臺的次數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與鹽水組和PGE1+K252a組大鼠相比，PGE1組和假手術(shù)組大鼠跨越原平臺的次數(shù)較多（P＜0.05）。PGE1組大鼠跨越原平臺的次數(shù)多于假手術(shù)組大鼠（P＜0.05）。

圖1 在進(jìn)行定位航行實驗中四組大鼠逃避潛伏期的比較

2.2 對四組大鼠進(jìn)行條件性恐懼實驗結(jié)果的比較

在第1 d，四組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在第2 d，在進(jìn)行環(huán)境及聲音刺激實驗中，假手術(shù)組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為（52.51±16.98）%、（77.07±14.56）%，鹽水組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為（37.80±10.86）%、（53.63±15.16）%，PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百 分 比 分 別 為 (49.91±12.39）%、（73.35±13.11)%，PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比分別為（28.54±13.23）%、（45.12±28.81）%。 在 進(jìn) 行 環(huán) 境 及聲音刺激實驗中，假手術(shù)組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比均大于鹽水組和PGE1+K252a組大鼠(P＜0.05）。假手術(shù)組和PGE1組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），鹽水組和PGE1+K252a組大鼠發(fā)生震驚反射時間的百分比相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 四組大鼠在不同條件下發(fā)生震驚時間百分比的比較

2.3 用光鏡觀察四組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的排列情況

假手術(shù)組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列緊密、均勻。鹽水組和PGE1+K252a組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列松散。PGE1組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的排列緊密、均勻，可見少許的脫落細(xì)胞。如圖3。

圖3用光鏡觀察四組大鼠腦組織切片中海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的排列情況

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中的海馬區(qū)域(特別是 CA1區(qū))與其認(rèn)知功能的關(guān)系密切。該區(qū)域中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF，brain-derived neurotrophic factor）水平的降低是誘發(fā)血管性癡呆的重要原因[9]。BDNF廣泛表達(dá)于哺乳類動物的大腦中，是一種具有多種效用的神經(jīng)營養(yǎng)因子。BDNF可促進(jìn)腦神經(jīng)元的修復(fù)、軸突的再生。TrkB（酪氨酸激酶受體B）是BDNF的一個具有高度親和力的受體。BDNF是通過與TrkB相結(jié)合來發(fā)揮作用[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可調(diào)節(jié)大鼠學(xué)習(xí)、認(rèn)知及情緒相關(guān)的行為[11]。此研究使調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路成為治療血管性癡呆的靶點。動物實驗證實，PGE1可上調(diào)VD大鼠體內(nèi)BDNF的表達(dá)。PGE1是臨床上治療人心腦血管疾病的常用藥[12]。此藥具有增加外周血流量、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)、抑制血小板聚集、舒張血管、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和促進(jìn)血管再生等作用。

本次實驗的結(jié)果顯示，用PGE1對VD大鼠進(jìn)行治療，可有效地改善其學(xué)習(xí)記憶功能，這與相關(guān)研究的結(jié)果相一致。與PGE1組大鼠相比，PGE1+K252a組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能較差。說明TrkB拮抗劑可阻礙BDNF與其受體TrkB相結(jié)合，進(jìn)而降低PGE1對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用。反言之，PGE1可通過調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路來提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

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