林麗+陳澤斌+何群香+徐松萍+華金珠+黃麗+徐勝光

摘要： 為了揭示煙草不同器官中內(nèi)生細菌的分布規(guī)律，應用Illumina測序平臺的MiSeq高通量測序儀對煙草根、莖、葉中內(nèi)生細菌的16S rDNA-V4區(qū)擴增子進行測序，對測得數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，評價物種α多樣性和β多樣性。經(jīng)FLASH軟件對序列進行拼接，莖、葉、根樣品分別獲得36 129、60 312、52 573條原始序列，經(jīng)Qiime軟件過濾，再剔除宿主的葉綠體和線粒體序列，最終分別得到35 190、58 938、51 268條有效序列，在97%的序列相似性水平上，這些有效序列被Uparse軟件劃分為1 447、1 141、1 220個操作分類單元（OTUs）。序列比對結(jié)果表明，在根、莖、葉中芽球菌屬（Blastococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢菌。類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Gemmatimonadaceae屬、Gaiella屬、壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌表現(xiàn)出組織專一性，主成分分析表明，根和葉中內(nèi)生細菌群落結(jié)構最為相似。煙草植株內(nèi)蘊含豐富的細菌資源，受組織結(jié)構及成分因素影響表現(xiàn)出器官差異性，即莖>根>葉。通過對煙草不同部位內(nèi)生細菌多樣性進行研究，可為煙草植物生物活性內(nèi)生菌株的發(fā)掘利用提供理論依據(jù)。

關鍵詞： 煙草；營養(yǎng)器官；內(nèi)生細菌；組成；多樣性；分布規(guī)律；生物信息學；宿主；優(yōu)勢菌；基因工程菌

中圖分類號： S572.01；Q939.92 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0274-05

植物內(nèi)生細菌（endophytic baeteria）泛指那些在其生活中的一定階段或全部階段生活于健康植物體內(nèi)對植物器官未引起明顯病害癥狀的微生物[1]。近年來，已知在地球上接近30種的高等植物中每個物種都與多種內(nèi)生細菌共生[2]。對煙草植物中內(nèi)生細菌的報道早就出現(xiàn)了，但大多采用一代測序進行研究分析，運用二代測序進行研究分析的報道少之又少。因此，本研究采用Illumina高通量測序平臺的MiSeq測序儀對煙草不同部位內(nèi)生細菌的16S rDNA擴增子進行二代測序，相較于傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)法以及基于一代測序的非培養(yǎng)方法，測序費用低，測序深度更大，檢測靈敏度更高，從而能更好地實現(xiàn)對煙草不同部位內(nèi)生細菌種類的準確調(diào)查，從而加深對煙草內(nèi)生細菌種群結(jié)構的了解。

內(nèi)生細菌是一個多樣性豐富的微生物類群，生活于健康植物的各個組織和細胞間隙內(nèi)，具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件的影響，可以在植物體內(nèi)獨立地分裂繁殖和傳遞，并與宿主植物協(xié)同進化[3]。內(nèi)生細菌長期生活在植物組織內(nèi)，與宿主形成共生關系，生態(tài)適應性強，產(chǎn)生活性物質(zhì)，并參與信息轉(zhuǎn)導作用直接作用于宿主本身，植物內(nèi)生細菌能夠促進宿主植物的生長、提高宿主植物的抗病蟲害能力、增強宿主植物抗逆性[4]，提高宿主植物對環(huán)境的適應性，加強系統(tǒng)的生態(tài)平衡。研究表明，高等植物中普遍存在內(nèi)生細菌，據(jù)不完全文獻統(tǒng)計，截至2010年，在各種農(nóng)作物及經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細菌已超過129種，分屬于54個屬，主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泛菌屬（Pantoea）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等[5]。陳澤斌等采用研磨組織稀釋分離法分離煙草植株中的內(nèi)生細菌，對不同組織器官、不同生長期的煙草內(nèi)生細菌菌群密度進行研究。結(jié)果表明，煙株的根、莖、葉中均存在大量的內(nèi)生細菌，煙草內(nèi)生細菌的分布存在品種差異、生長期差異、組織部位差異。在整個生育期中，以成熟期內(nèi)生細菌的數(shù)量最多[6]。他們還采用稀釋平板法從健康煙草的根、莖、葉組織中分離到267株內(nèi)生細菌，并利用細菌菌落表征性狀和16S rRNA序列對這些分離物進行多樣性分析。經(jīng)克隆測序分析表明，這267株分離物分別與GenBank中6類細菌中的21個已知種相似性達到98%～99%[7]。王茂勝等為揭示煙草內(nèi)生細菌多樣性，選擇K326、云85和紅花大金元3個烤煙品種進行內(nèi)生細菌的分離和16S rDNA序列分析鑒定，獲得不同品種煙草內(nèi)生細菌的多樣性特征。結(jié)果顯示，3個品種的香農(nóng)指數(shù)以K326最高，為2.02；其次是云煙85，為1.48；紅花大金元最低，為1.30[8]。這些研究進展所采用的都是一代測序技術，然而早期一代測序技術普遍存在諸如文庫構建過程復雜、測序成本較高、通量低、難以做大量的平行測序等缺點。為了克服上述缺點，筆者利用近年來發(fā)展的新二代測序技術，不僅在文庫構建等方面取得了重要突破，進一步簡化了測序操作，降低了測序成本，縮短了測序時間；而且二代測序技術的出現(xiàn)使DNA測序的通量有所提高，原來只有在大型測序中心才能完成的測序任務現(xiàn)在已經(jīng)可以在更多的實驗室展開。本研究采用近年來興起的Illumina MiSeq二代測序技術對煙草根、莖、葉內(nèi)生細菌種類組成進行分析，相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法及以16S rDNA為基礎的非培養(yǎng)方法，能夠產(chǎn)生測序覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量，從而對煙草內(nèi)生細菌的種類進行全面而準確的調(diào)查，為豐富植物微生態(tài)學理論及基因工程菌的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年7月27日于云南省宣威市落水鎮(zhèn)試驗田隨機選取10株成熟期健康無明顯病害煙草，煙草品種為云煙87，采集其根、莖、葉放入無菌樣品袋中，均勻混合，低溫保鮮，24 h內(nèi)進行表面消毒處理。

1.2 表面消毒

將烤煙根、莖、葉用滅菌水沖洗干凈，先用1%次氯酸鈉浸泡5 min，再用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分，表面消毒效果接近100%[9]。

1.3 總DNA提取

按參考文獻[10]所采用的CTAB方法提取根、莖、葉的總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的完整度和濃度，并將剩余的樣品存于2 mL離心管中，使用無菌水稀釋樣品DNA至1 ng/μL。endprint