邢玉娟+王建國+陳玉庫+胡元亮+王德云+蔡丙嚴(yán)

摘要： 將14日齡非免疫健康羅曼蛋公雞594羽隨機均分為11組，1～9組分別為OM-APS、OM和APS的高、中、低劑量組，10組為免疫對照組，11組為空白對照組。除空白對照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點眼免疫，28日齡重復(fù)免疫。在首次免疫的同時，1～9組分別口服高、中、低劑量藥物，疫苗對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別于14、21、28、35、42日齡采血，用MTT法測定T淋巴細(xì)胞增殖的變化，用β-微量法測定血清抗體效價變化。于14、21、28、35日齡，每組隨機抽取4羽，稱體質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱體質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)。于69日齡用新城疫強毒攻毒，觀察保護率。結(jié)果表明，OM-APS、OM、APS的高、中濃度在各時間點均能促進T淋巴細(xì)胞增殖；OM-APS高、中濃度在各時間點抗體效價明顯高于免疫對照組；OM-APS的高、中、低濃度在各時間點的脾指數(shù)、高、中濃度各時間點的法氏囊指數(shù)均明顯高于免疫對照組；OM-APS、APS的高、中、低濃度，OM中、低濃度的攻毒保護率均高于或明顯高于免疫對照組。

關(guān)鍵詞： 中藥成分復(fù)方；T淋巴細(xì)胞增殖；新城疫疫苗；免疫應(yīng)答；抗體效價；免疫器官指數(shù)；攻毒保護率

中圖分類號： S853.74 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0182-05

研究證明，中藥作為一種免疫增強劑，具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優(yōu)勢，不僅能克服油乳類、鋁膠類化學(xué)佐劑副作用大、局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不能足提高弱抗原的免疫原性等弊病 ，而且能顯著增強機體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌[3-4]。

在以前的研究中，筆者首先通過體外試驗篩選出OM、APS等中藥成分，這些成分具有顯著抑制NDV病毒增殖的作用，然后比較了中藥成分復(fù)方體外抗NDV感染的效果。結(jié)果表明，中藥成分復(fù)方高、中、低濃度能顯著抑制NDV感染CEF[5]。并通過臨床試驗比較了中藥成分復(fù)方對雛雞人工感染新城疫的療效，結(jié)果表明，中藥成分復(fù)方在攻毒前、攻毒時和攻毒后3種給藥方式，均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價，減輕死亡雞的器官出血[6]。

本試驗在測定了4種中藥成分及其4個復(fù)方對雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖影響的基礎(chǔ)上，進一步測定了中藥成分復(fù)方及其組分藥配合新城疫疫苗免疫后雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖的變化，血清抗體效價的變化，對法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)以及對攻毒保護率的影響，通過各中藥組和免疫對照組、空白對照組差異比較的觀察，進一步探討中藥成分復(fù)方免疫增強的作用機理，為研制中藥成分免疫增強劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

根據(jù)以前的試驗結(jié)果[5-6]，分別用雙蒸水將OM、APS和OM-APS（OAP）稀釋成高（4 mg/mL）、中（2 mg/mL）、低（1 mg/mL）3種濃度，常規(guī)消毒后備用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系（newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ）疫苗，中牧股份南京藥械廠生產(chǎn)，批號753-3。新城疫檢測抗原，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)研究室提供。新城疫強毒（newcastle disease virus，NDV）E01株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室提供。將病毒按常規(guī)方法接種9日齡SPF雞胚，恒溫培養(yǎng)72 h，收獲尿囊液，按Reed-Muench法[7]測定EID50為10-8.83。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4 ℃保存，臨用前加入犢牛血清達(dá)5%和青霉素、鏈霉素各100 IU/mL；植物血凝素（PHA），上海伊華科技有限公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成 0.1 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液，Amresco公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，使終濃度為5.0 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4 ℃冰箱避光保存；淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞裂解液，二甲亞砜（DMSO），分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.4 試驗動物

1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞594羽，購自湯泉農(nóng)墾種雞場。試驗期間采用籠養(yǎng)，全價飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.5 試驗設(shè)計

雛雞飼養(yǎng)至14日齡（平均體質(zhì)量95 g，平均母源抗體效價3.3log2時，隨機均分為11組（每組54羽）。1～9組為OAP高劑量組（OAPH）、OAP中劑量組（OAPM）、OAP低劑量組（OAPL）、OM高劑量組（OMH）、OM中劑量組（OMM）、OM低劑量組（OML）、APS高劑量組（APSH）、APS中劑量組（APSM）和APS低劑量組（APSL），10組為疫苗對照組，11組為空白對照組。除空白對照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點眼免疫，每羽4羽份。28日齡重復(fù)免疫。在首次免疫的同時，3個中藥復(fù)方組分別口服高、中、低劑量的OAP復(fù)方，每羽1.0 mL，6個單味藥對照組分別口服高、中、低劑量的OM和APS，每羽1.0 mL，免疫對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別于14、21、28、35、42日齡，每組隨機抽取4羽，無菌心臟采血（每羽4.0 mL），肝素抗凝，測定外周血淋巴細(xì)胞增殖；每組隨機抽取10羽翼靜脈采血，分離血清，用β-微量法測定HI抗體效價；在14、21、28、35日齡，每組隨機抽取4羽，稱質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)（免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）；于69日齡用新城疫強毒攻毒，觀察保護率。endprint

1.6 淋巴細(xì)胞增殖測定方法

采用MTT法[3-4，8]。將抗凝血樣（每羽4.0 mL）用Hanks液稀釋1倍，小心加在淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用無血清RPMI1640營養(yǎng)液洗2遍，1 500 r/min離心15 min。臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計數(shù)活細(xì)胞大于90%后，用RPMI1640營養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.5×106個/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（德國Nunclon公司生產(chǎn)）中，80 μL/孔，再加20 μL/孔 PHA，每個樣品重復(fù)4孔，然后置于39.5 ℃、5% CO2條件下（CO2培養(yǎng)箱，美國Revco公司產(chǎn)品）培養(yǎng)44 h，取出，加入MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加裂解液100 μL/孔，將細(xì)胞板置于微量振蕩器（75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)）上振蕩 5 min 使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀（DG-3022型，中國華東電子管廠生產(chǎn)）上檢測570 nm處的吸光度（D570 nm）作為T淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.7 抗體效價測定方法

在96孔微量血凝板上，從左到右各加50 μL/孔 PBS液，再向每排的第1孔加入50 μL待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50 μL 4個單位抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min；取出，加入50 μL/孔雞紅細(xì)胞懸液，同時設(shè)陽性血清、陰性血清及空白對照孔。振蕩混勻后置于37 ℃溫箱中感作30 min，待對照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時觀察結(jié)果[7]。

1.8 攻毒保護率測定方法

除空白對照組外，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將新城疫病毒E01株稀釋100倍，肌肉注射0.5 mL/羽。每天記錄各組死亡數(shù)，死亡雞剖檢，至攻毒后8 d停止死亡時計算死亡率和攻毒保護率。

1.9 數(shù)據(jù)處理

淋巴細(xì)胞D570 nm值、HI效價和免疫器官指數(shù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS軟件11.0統(tǒng)計分析，比較各時間點淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗體效價和免疫器官指數(shù)的差異性。死亡率和攻毒保護率用t檢驗比較各組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細(xì)胞增殖的變化

各時間點D570 nm值均顯著高于空白對照組（P<0.05）。[HJ1.3mm]OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各時間點，OAPL和APSL在21、28、35、42日齡，OML在21、28、42日齡的D570 nm值顯著高于免疫對照組。

OAPH在各時間點D570 nm值均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM在28日齡D570 nm值高于APSM，但差異不顯著，其余各時間點D570 nm 值均明顯高于OMM和APSM（P<0.05）；各復(fù)方組和OMH、APSH在21日齡D570 nm值達(dá)到高峰，其余各單味藥對照組在28日齡達(dá)到高峰（表1）。

2.2 抗體效價的變化

各時間點抗體效價均顯著高于空白對照組（P<0.05）；OAPH、OAPM在14日齡，OAPH、OAPM、OAPL、APSH、APSM、APSL、OMH、OMM在21日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和APSM在28日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在35

日齡，OAPH、OAPM、APSM在42日齡抗體效價顯著高于免疫對照組（P<0.05）。

OAPH的抗體效價在各時間點均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗體效價在21、28、35、42日齡顯著高于OMM，在21、28、35日齡顯著高于APSM（P<005）；OAPL抗體效價在28日齡顯著高于OML（P<0.05，表2）。

2.3 免疫器官指數(shù)的變化

2.3.1 法氏囊指數(shù)的變化

OML、OPAL免疫對照組和空白對照組的法氏囊指數(shù)在21日齡達(dá)到峰值，其他各組在28日齡達(dá)到峰值；各藥物組及免疫對照組法氏囊指數(shù)均顯著高于空白對照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各時間點，OMH在21、28日齡，OAPL在14、21、28日齡法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對照組（P<0.05）。OAPH的法氏囊指數(shù)在各時間點均顯著高于OMH，在28、35日齡顯著高于APSH，OAPM的法氏囊指數(shù)在35日齡顯著高于APSM（表3）。

2.3.2 脾指數(shù)的變化

OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各時間點，OMH在14、35日齡，OML、APSL在14、21、35日齡脾指數(shù)顯著高于空白對照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各時間點，OML在21日齡，APSL在14、21日齡的脾指數(shù)均顯著高于免疫對照組（P<0.05）。

OAPH在各時間點均顯著高于OMH，OAPM在21、28、35日齡顯著高于OMM，在28日齡顯著高于APSM，OAPL在14、28日齡顯著高于OML（表4）。

2.4 攻毒保護率的變化

攻毒后24 h，雞出現(xiàn)精神萎靡，蹲伏籠角；食欲減退或廢絕，垂頭縮頸，羽毛松散、粗亂，翅膀下垂，閉眼昏睡，伸頸張口呼吸等癥狀，少數(shù)病雞出現(xiàn)神經(jīng)癥狀；腹瀉，排黃白色或黃綠色水樣糞便。48 h開始出現(xiàn)死亡，72～96 h各組死亡數(shù)均達(dá)到高峰，隨后開始下降，至攻毒后192 h停止死亡。死亡的雞剖檢，可見典型的新城疫變化，喉頭、氣管有多量黏液，黏膜有出血點或出血斑；腺胃黏膜腫脹，乳頭出血；盲腸扁桃體腫大、出血；腸管嚴(yán)重出血；脾腫大、出血。

各組保護率極顯著高于空白對照組（P<0.001）；OAP高、中劑量組保護率顯著高于免疫對照組（P<0.05），APS的高、中、低濃度、OM中、低濃度保護率均高于免疫對照組，由高到低依次為OAPM、OAPH、APSH、APSM、OMM、OAPL、OML和APSL（表5）。endprint

3 討論

3.1 中藥成分復(fù)方及其組分藥對淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機體細(xì)胞免疫水平的一個重要指標(biāo)[9]。細(xì)胞免疫是通過致敏淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。本試驗結(jié)果表明，9個試驗藥物組中，除OAPL、OML、APSL在14日齡，OML在35日齡外，其余各組、各時間點的D570 nm值均顯著高于免疫對照組。說明復(fù)方、APS和OM在合適的劑量下均能刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞免疫，其中以O(shè)APM、OAPH的效果最好。

3.2 中藥成分復(fù)方及其組分藥對新城疫疫苗免疫應(yīng)答的影響

血清抗體效價反映機體體液免疫狀態(tài)[10]，體液免疫是機體抗御感染的主要因素之一，通過抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用。本試驗結(jié)果表明，OAPH、OAPM和APSM在5個時間點，OMM在4個時間點，OAPL和APSH在3個時間點，OMH和APSL在1個時間點的抗體效價顯著高于免疫對照組。表明OAP、APS和OM在合適的劑量下均能刺激抗體產(chǎn)生，提高機體體液免疫水平，其中以O(shè)APH、OAPM和APSM的作用最強。

3.3 中藥成分復(fù)方及其組分藥對免疫器官指數(shù)的影響

一般認(rèn)為，免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致，而免疫器官指數(shù)增加則為免疫增強的表現(xiàn)[11]。在本試驗中，OAPH、OAPM在各時間點法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)均明顯高于免疫對照和空白對照組，OAPL在14、21、28日齡法氏囊指數(shù)和各時間點的脾指數(shù)顯著高于免疫對照組。除OMH在14、35日齡以及OAPL在35日齡法氏囊指數(shù)高于免疫對照但差異不顯著外，其余各藥物組法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對照組（P<0.05）。在脾指數(shù)方面，OMH在各時間點，OML在14、28、35日齡，APSL在28、35日齡外，其余各組、各時間點均顯著高于免疫對照組（P<0.05）。表明中藥成分復(fù)方及其組分藥能增加免疫器官質(zhì)量，從而增強機體的免疫功能。

3.4 中藥成分復(fù)方及其組分藥對免疫保護力的影響

攻毒保護率直接反映動物的抗病力，中藥可直接殺滅侵入機體的病毒，或通過增強疫苗的免疫應(yīng)答而提高保護率[12-14]。本試驗將各組雞在69日齡用NDV強毒進行攻毒，OAPH、OAPM的保護率分別達(dá)到91.82%、95.72%，顯著高于免疫對照組（P<0.05），APS的3個濃度組、OMM、OML和OAPL的攻毒保護率也高于免疫對照組，表明OAP及中藥組能顯著提高或提高新城疫疫苗的免疫應(yīng)答，從而提高雛雞對新城疫的抗病能力。

3.5 復(fù)方及其組分藥增強免疫作用有一定的量效關(guān)系

本試驗發(fā)現(xiàn)，OAP增強免疫作用有一定的量效關(guān)系。在促進T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH、OAPM在各時間點均顯著高于免疫對照組，而OAPL在14日齡則與免疫對照組無顯著差異。OM和APS的高、中劑量組在各時間點與免疫對照組相比差異顯著，而低劑量組在14日齡與免疫對照組無顯著差異，是否因為劑量過小，不足以刺激機體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞，還有待于進一步研究；在提高血清抗體效價方面，OAPH、OAPM在各個時間點均顯著高于免疫對照組，OAPL在21、28和35日齡顯著高于免疫對照組；在提高法氏囊指數(shù)方面，OAPH、OAPM各時間點顯著高于免疫對照，OAPL在14、21、28日齡顯著高于免疫對照，在35日齡與對照組相比較差異不顯著?？紫榉宓仍谟^察9種中藥成分對新城疫Ⅳ系疫苗免疫雛雞血清中血凝抑制抗體水平的影響，也得到相似的結(jié)果[15-16]。

3.6 復(fù)方增強免疫作用優(yōu)于單味組分藥

OAP是由OM和APS組成的復(fù)方，其增強免疫作用優(yōu)于單味組分藥，表明2種組分藥有協(xié)同作用。在促進T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH在各時間點D570 nm值均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）。OAPM在28日齡D570 nm值高于APSM，但差異不顯著，其余各時間點D570 nm值均顯著高于OMM和APSM（P<0.05）。Wang等觀察當(dāng)歸多糖、黃芪多糖及其復(fù)方等對培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖、抗體生成、細(xì)胞因子分泌的影響，也得到相似結(jié)果[17-18]。Fan等研究中藥成分黃酮及其復(fù)方增強免疫作用時也發(fā)現(xiàn)，復(fù)方的作用效果優(yōu)于單味成分[19]。

在提高血清抗體效價方面，OAPH抗體效價在各時間點均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗體效價在21、28、35、42日齡顯著高于OMM，21、28、35日齡顯著高于APSM（P<0.05）；OAPL抗體效價在28日齡顯著高于OML（P<0.05）。

在提高免疫器官指數(shù)方面，OAPH的法氏囊指數(shù)在各時間點均顯著高于OMH，在28、35日齡顯著高于APSH；OAPM的法氏囊指數(shù)在35日齡顯著高于OMM和APSM；在提高脾指數(shù)方面，OAPH在各時間點均顯著高于OMH，OAPM在21、28、35日齡顯著高于OMM，在28日齡顯著高于APSM，OAPL在14、28日齡顯著高于OMM。表明2種組分藥有協(xié)同作用。

綜合以上結(jié)果可見，OAP能顯著增強雛雞對新城疫疫苗的免疫應(yīng)答，中、高劑量的效果較好，顯著優(yōu)于單味組分。鑒于中、高劑量的效果多差異不顯著，推薦臨床使用OAP中劑量配合疫苗使用，可作為新型免疫增強劑的候選方。

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