王慶容+徐曉舒+夏浪+楊秀榮

摘要： 取草魚(yú)的腎組織、肝組織、腸組織，選擇25、35、45 ℃這3種不同溫度進(jìn)行HE染色，以觀察不同溫度條件下的染色效果。結(jié)果表明，在35 ℃溫度時(shí)所染的裝片脫蠟較為徹底，染色效果很明顯，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞之間的間隙可以清晰看到；而在25、45 ℃溫度條件下染色效果則不明顯。

關(guān)鍵詞： 草魚(yú)；HE染色；組織切片；最適溫度；染色效果

中圖分類號(hào)： S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0168-02

HE染色即蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining），是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法[1]。蘇木精可以將組織的嗜堿性結(jié)構(gòu)（如核糖體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的核糖核酸等）染成藍(lán)紫色，伊紅可以將組織的嗜酸性結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，包括路易體、酒精小體以及細(xì)胞質(zhì)的大部分）染成粉紅色，使整個(gè)細(xì)胞組織的形態(tài)清晰可見(jiàn)[2]。組織切片方法是教學(xué)、科研、病理檢驗(yàn)工作中非常常用的一種試驗(yàn)方法，HE染色則是在制作切片的過(guò)程中最常用的染色方法[3]。

在實(shí)際試驗(yàn)操作過(guò)程中并不是每一張切片的質(zhì)量都會(huì)出現(xiàn)預(yù)期的效果，而各種因素都會(huì)對(duì)切片的質(zhì)量產(chǎn)生影響[4]。因此，制備一張質(zhì)量好的切片，考慮的因素必須是多方面的，而溫度的影響則是不可忽視的因素之一。

本試驗(yàn)選擇外觀正常、生長(zhǎng)狀況良好、體表無(wú)明顯病變的草魚(yú)，處死后取其腎、肝、腸分別進(jìn)行組織學(xué)切片，選擇25、35、45 ℃等不同的溫度處理，觀察在不同溫度條件下的染色效果，以期找出HE染色的最適溫度，為組織切片的染色技術(shù)提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

草魚(yú)的腎、肝、腸組織切片。

1.1.2 試劑配制

常用于組織學(xué)切片制作的試劑有Bouin氏液（苦味酸75 mL、40%甲醛25 mL、冰醋酸5 mL）、粘合劑（雞蛋清）、清洗液（重鉻酸鉀80 g、水1 000 mL、粗制濃硫酸120 mL）、乙醇（分別配制了70%、80%、90%、95%、100% 5種濃度）、1/2二甲苯（乙醇和二甲苯按1 ∶ 1比例配制）、氨水（1%）、酸水（1%）、0.2%蘇木精染色液（蘇木精6 g、無(wú)水乙醇100 mL、硫酸鋁鉀150 g、蒸餾水2 000 mL、碘酸鈉1.2 g、冰醋酸120 mL、甘油900 mL）、0.5%～1.0%伊紅染色液（95%乙醇配制）等。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

本試驗(yàn)所用的儀器主要有精密電子天平 （AUY）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-5型）、包埋機(jī)（徠卡YB-6LF）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（徠卡RM2016）、攤片機(jī)（徠卡HI1210）等。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)的主要步驟如下：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、展片、染色、封片、鏡檢觀察，詳細(xì)步驟參考唐從國(guó)等的方法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件下草魚(yú)腎組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察3種溫度條件下進(jìn)行的HE染色，可以明顯發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時(shí)，由于溫度較低，組織之間的蠟塊沒(méi)有完全脫掉，細(xì)胞核模模糊糊，不呈藍(lán)色，顏色比較暗沉，不清晰，染色效果不明顯（圖1-a）；在35 ℃時(shí)，可以清晰地看到細(xì)胞間的界限，細(xì)胞核呈藍(lán)色，其他部分呈紅色或者粉紅色，細(xì)胞排列緊密、 規(guī)則，染色效果很明顯（圖1-b）；45 ℃時(shí)染色效果比35 ℃的差，可以看到細(xì)胞界限，但是部分組織或者細(xì)胞核破裂，細(xì)胞核著色不明顯或發(fā)灰（圖1-c）。以上結(jié)果顯示，對(duì)于草魚(yú)的腎臟組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

2.2 不同溫度條件下草魚(yú)肝組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察不同溫度條件下肝組織的切片，可以發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時(shí)，肝組織中有很多蠟塊沒(méi)有脫掉，細(xì)胞核模糊，但形態(tài)依稀可見(jiàn)，細(xì)胞界限不清晰，細(xì)胞核能被染成藍(lán)色，但是染色效果不明顯（圖2-a）；在35 ℃時(shí)，可以很清晰地看到肝細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞核大而圓，且被染成藍(lán)色，周圍的組織也被染成粉紅色或者紅色，細(xì)胞界限清晰，染色效果較好（圖2-b）；在45 ℃時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間的界限比較模糊，隱約可以看到細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色，少數(shù)組織染色不均，染色效果較35 ℃時(shí)稍差（圖2-c）。以上結(jié)果顯示，對(duì)于草魚(yú)的肝臟組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

2.3 不同溫度條件下草魚(yú)腸組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察不同溫度條件下的草魚(yú)腸組織切片，可以發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時(shí)，跟腎組織和肝組織切片一樣，組織塊之間的蠟沒(méi)脫完全， 可以隱約看到腸絨毛，細(xì)胞界限不清晰，細(xì)胞核

染色較明顯（圖3-a）；在35 ℃時(shí)，可以看出腸組織結(jié)構(gòu)完整，腸壁肌肉層均可清晰看到，腸細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，腸絨毛排列整齊、清晰，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，周圍其他組織被染成粉紅色（圖3-b）；在45 ℃時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)組織之間的蠟塊被脫掉，但是細(xì)胞核由于受到高溫，著色不明顯，且組織之間出現(xiàn)裂痕（圖3-c）。以上結(jié)果顯示，對(duì)于草魚(yú)的腸組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

3 討論與結(jié)論

影響組織切片HE染色效果的因素很多，溫度是較敏感的因素之一。要做好一張HE組織切片，須注意許多細(xì)節(jié)問(wèn)題。取材時(shí)要注意整個(gè)組織的形態(tài)特點(diǎn)，組織塊大小適宜、厚薄均勻、形狀規(guī)則，一般大小為3～5 mm，夾取組織時(shí)不能用力擠壓，避免機(jī)械損傷[6]。在制作組織切片的過(guò)程中，溫度對(duì)染色效果的影響比較明顯，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生直接影響。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，二甲苯的脫蠟達(dá)不到預(yù)期的效果，組織內(nèi)蠟太厚，不僅不利于細(xì)胞核以及胞漿著色，而且還不利于觀察。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，脫蠟或許能達(dá)到目的，但是高溫也會(huì)對(duì)裝片產(chǎn)生很多影響，如著色不明顯、發(fā)灰等。在制作切片的過(guò)程中，低溫時(shí)需要在脫蠟這一環(huán)節(jié)延長(zhǎng)時(shí)間，這樣就不能在有效的時(shí)間內(nèi)制作出一張令人滿意的裝片，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且還浪費(fèi)試驗(yàn)材料。因此，本研究采用恒溫箱，選取3種不同溫度進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證了35 ℃左右為較合適的染色溫度，在一定程度上節(jié)約了時(shí)間和試驗(yàn)材料。endprint

當(dāng)然，溫度并不是影響組織切片染色的唯一因素，染色前期的很多試驗(yàn)步驟對(duì)染色的影響也很大，包括取材、固定、浸蠟、烤片等步驟。如果固定不及時(shí)、不充分會(huì)造成細(xì)胞著色差或者發(fā)灰、組織結(jié)構(gòu)模糊不清等。浸蠟、烤片這方面的因素容易被忽視，很多情況下細(xì)胞核發(fā)灰都與其相關(guān)，如果浸蠟、烤片溫度過(guò)高，就會(huì)造成組織收縮變脆、細(xì)胞核染色不明顯或發(fā)灰等。一些試劑（蘇木精、伊紅等）在染色過(guò)程也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

在25 ℃溫度條件下，裝片的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色不明顯，細(xì)胞核模糊不清，細(xì)胞界限不清晰，是因?yàn)榻M織塊脫蠟不徹底。組織塊在二甲苯中脫蠟需要合適的溫度，溫度過(guò)低，將導(dǎo)致脫蠟不徹底。在35 ℃溫度條件下，裝片的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色很明顯，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色或藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色或者粉紅色，細(xì)胞界限清晰，脫蠟較為徹底，能達(dá)到試驗(yàn)的目的。在45 ℃溫度條件下，裝片的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色也比較明顯，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色或者粉紅色，細(xì)胞界限可以大致看到模糊的輪廓。溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致組織塊出現(xiàn)裂痕，部分細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)破裂。

[JP+1]綜上所述，在組織切片時(shí)，夏天溫度高，在常溫下染色可以達(dá)到目的，但是冬季溫度低，應(yīng)該在恒溫箱內(nèi)染色，且最理想的HE染色的溫度應(yīng)該控制在32～37 ℃之間。溫度低了，組織塊之間脫蠟就不完全，引起細(xì)胞核模糊不清，染色著色不明顯，并且細(xì)胞之間的界限也不清晰；溫度高了又會(huì)使得細(xì)胞破裂，組織結(jié)構(gòu)之間出現(xiàn)裂痕，細(xì)胞核著色不明顯或發(fā)灰。

參考文獻(xiàn)：

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[3]王 華，周孝瓊. 病理組織切片中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法[J]. 實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2010，8（5）：38-40.

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[5]唐從國(guó)，郭周慶. 如何做好一張HE染色切片[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21（4）：428-429

[6]范小莉，胥維勇，楊 群. HE染色不良的分析與應(yīng)對(duì)方法[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（7）：805-807.endprint