余波+楊莉+史開志+任榮清+徐景峨+楊粵黔

摘要： 為建立快速診斷豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）的方法和耐藥情況，根據(jù)GenBank中的APP apxIVA基因，設(shè)計(jì)合成2對引物，通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了APP LAMP診斷方法，同時(shí)對分離到的APP進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示，建立的LAMP診斷方法最低核酸檢測量為2 pg/μL，對豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，擴(kuò)增反應(yīng)30 min內(nèi)完成，結(jié)果肉眼可見。分離得到的31株APP，耐藥性較強(qiáng)。結(jié)果表明，建立的方法可滿足基層現(xiàn)場快速檢測需要，對分離得到的31株APP耐藥性分析表明，APP耐藥性較嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞： 傳染性胸膜肺炎放線桿菌；apxIVA基因；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；耐藥性分析

中圖分類號： S858.285.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0165-03

豬傳染性胸膜肺炎是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起以纖維性肺炎為主要特征的豬呼吸道疾病[1]。急性發(fā)病時(shí)，豬死亡率較高，出現(xiàn)呼吸嚴(yán)重困難，體溫升高，食欲減退，剖檢可見肺部與胸膜粘連；慢性發(fā)病時(shí)，豬死亡率較低，但生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低。該病自1987年在我國被發(fā)現(xiàn)以來，貴州省各地報(bào)道較多，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。近年來，由于抗生素的濫用，APP耐藥性日益嚴(yán)重[5-7]。為對APP進(jìn)行現(xiàn)場快速診斷以及了解其耐藥情況，根據(jù)GenBank中的APP apxIVA基因，設(shè)計(jì)合成2對引物，通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）的擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了APP LAMP診斷方法。同時(shí)，對分離的APP進(jìn)行耐藥性分析，為防治APP提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)菌

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1～15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌由貴州畜禽重大疫病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR試劑盒由貴州省畜禽重大疫病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的APP 1～15型apxIVA基因序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計(jì)4條特異性引物，包括外引物和內(nèi)引物（F3、B3、FIP、BIP）。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序號如下：

F3：5′-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3′；B3：5′-GCCCCACAATGACGTGTAC-3′；

FIP：5′-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3′；

BIP：5′-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3′。

1.2.2 細(xì)菌核酸的提取

（1）臨床樣品：取1.0 g病豬肺臟、淋巴結(jié)加入2 mL 0.1 mol/L PBS 研磨后，反復(fù)凍融3次，5 000 r/min 離心5 min，取上清液用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

（2）細(xì)菌樣品：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.3 LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化

LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化主要包括擴(kuò)增溫度（分別為60、65、70 ℃），擴(kuò)增時(shí)間（分別為15、30、45 min），F(xiàn)3、B3引物濃度（分別為5、10、20 μmol/L），F(xiàn)IP、BIP引物濃度（分別為10、20、40 μmol/L），Bst DNA聚合酶用量（分別為0.5、1.0、2.0 U）。

LAMP反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，引物F3、B3各2 μL，引物FIP、BIP 4 μL，Bst DNA聚合酶1 μL（0.5、1.0、2.0 U），LAMP反應(yīng)緩沖液12.5 μL，模板1.0 μL，加入環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測試劑盒的熒光顯色液1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物于紫外光下進(jìn)行觀察。

1.2.4 敏感性試驗(yàn)

將提取的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Ⅰ型核酸用核酸蛋白儀測定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋用于LAMP、PCR反應(yīng)，以確定建立的LAMP診斷方法的敏感性。PCR試劑盒敏感性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1～15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌DNA為模板分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以確定建立的LAMP診斷方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的LAMP診斷方法，重復(fù)檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1～15型3次以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.7 建立的LAMP對臨床樣品的檢測

2014年3月至2016年3月，在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣 15個(gè)規(guī)模場和48家養(yǎng)殖戶236份疑似病豬樣品采用建立的LAMP診斷方法進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用研制的PCR診斷試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.8 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌耐藥性分析

2014年3月至2016年3月，對在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣的15個(gè)規(guī)模場和48家養(yǎng)殖戶分離得到的APP采用藥敏紙片法檢測分離菌對18種抗生素藥物的敏感性，藥敏試紙片包括青霉素、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑林、鏈霉素、慶大霉素、氟哌酸、恩諾沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、紅霉素、利福平、泰樂菌素、卡那霉素、土霉素、林可霉素、磺胺二甲嘧啶鈉。將分離純化的細(xì)菌涂布在含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，置于5% CO2 37 ℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察并測量抑菌圈直徑，判定標(biāo)準(zhǔn)參考杭州微生物試劑有限公司說明書。endprint