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        豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷方法的建立及耐藥性調(diào)查

        2018-01-06 07:53:26余波楊莉史開志任榮清徐景峨楊粵黔
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期

        余波+楊莉+史開志+任榮清+徐景峨+楊粵黔

        摘要: 為建立快速診斷豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)的方法和耐藥情況,根據(jù)GenBank中的APP apxIVA基因,設(shè)計合成2對引物,通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)擴(kuò)增條件的優(yōu)化,建立了APP LAMP診斷方法,同時對分離到的APP進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示,建立的LAMP診斷方法最低核酸檢測量為2 pg/μL,對豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,擴(kuò)增反應(yīng)30 min內(nèi)完成,結(jié)果肉眼可見。分離得到的31株APP,耐藥性較強。結(jié)果表明,建立的方法可滿足基層現(xiàn)場快速檢測需要,對分離得到的31株APP耐藥性分析表明,APP耐藥性較嚴(yán)重。

        關(guān)鍵詞: 傳染性胸膜肺炎放線桿菌;apxIVA基因;環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增;耐藥性分析

        中圖分類號: S858.285.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2017)22-0165-03

        豬傳染性胸膜肺炎是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染引起以纖維性肺炎為主要特征的豬呼吸道疾病[1]。急性發(fā)病時,豬死亡率較高,出現(xiàn)呼吸嚴(yán)重困難,體溫升高,食欲減退,剖檢可見肺部與胸膜粘連;慢性發(fā)病時,豬死亡率較低,但生長緩慢,飼料轉(zhuǎn)化率低。該病自1987年在我國被發(fā)現(xiàn)以來,貴州省各地報道較多,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。近年來,由于抗生素的濫用,APP耐藥性日益嚴(yán)重[5-7]。為對APP進(jìn)行現(xiàn)場快速診斷以及了解其耐藥情況,根據(jù)GenBank中的APP apxIVA基因,設(shè)計合成2對引物,通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)的擴(kuò)增條件的優(yōu)化,建立了APP LAMP診斷方法。同時,對分離的APP進(jìn)行耐藥性分析,為防治APP提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 細(xì)菌

        豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1~15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌由貴州畜禽重大疫病防制重點實驗室保存。

        1.1.2 主要試劑

        環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法熒光檢測試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR試劑盒由貴州省畜禽重大疫病防制重點實驗室研制;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 引物設(shè)計

        根據(jù)GenBank中的APP 1~15型apxIVA基因序列,應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計4條特異性引物,包括外引物和內(nèi)引物(F3、B3、FIP、BIP)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序號如下:

        F3:5′-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3′;B3:5′-GCCCCACAATGACGTGTAC-3′;

        FIP:5′-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3′;

        BIP:5′-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3′。

        1.2.2 細(xì)菌核酸的提取

        (1)臨床樣品:取1.0 g病豬肺臟、淋巴結(jié)加入2 mL 0.1 mol/L PBS 研磨后,反復(fù)凍融3次,5 000 r/min 離心5 min,取上清液用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

        (2)細(xì)菌樣品:采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

        1.2.3 LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化

        LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化主要包括擴(kuò)增溫度(分別為60、65、70 ℃),擴(kuò)增時間(分別為15、30、45 min),F(xiàn)3、B3引物濃度(分別為5、10、20 μmol/L),F(xiàn)IP、BIP引物濃度(分別為10、20、40 μmol/L),Bst DNA聚合酶用量(分別為0.5、1.0、2.0 U)。

        LAMP反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行,引物F3、B3各2 μL,引物FIP、BIP 4 μL,Bst DNA聚合酶1 μL(0.5、1.0、2.0 U),LAMP反應(yīng)緩沖液12.5 μL,模板1.0 μL,加入環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法熒光檢測試劑盒的熒光顯色液1.0 μL,用ddH2O補足至25.0 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物于紫外光下進(jìn)行觀察。

        1.2.4 敏感性試驗

        將提取的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Ⅰ型核酸用核酸蛋白儀測定濃度后,經(jīng)10倍系列稀釋用于LAMP、PCR反應(yīng),以確定建立的LAMP診斷方法的敏感性。PCR試劑盒敏感性試驗參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

        1.2.5 特異性試驗

        以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1~15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌DNA為模板分別進(jìn)行LAMP反應(yīng),以確定建立的LAMP診斷方法的特異性。

        1.2.6 重復(fù)性試驗

        應(yīng)用建立的LAMP診斷方法,重復(fù)檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1~15型3次以檢驗結(jié)果的可靠性。

        1.2.7 建立的LAMP對臨床樣品的檢測

        2014年3月至2016年3月,在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣 15個規(guī)模場和48家養(yǎng)殖戶236份疑似病豬樣品采用建立的LAMP診斷方法進(jìn)行檢測,同時應(yīng)用研制的PCR診斷試劑盒進(jìn)行檢測。

        1.2.8 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌耐藥性分析

        2014年3月至2016年3月,對在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣的15個規(guī)模場和48家養(yǎng)殖戶分離得到的APP采用藥敏紙片法檢測分離菌對18種抗生素藥物的敏感性,藥敏試紙片包括青霉素、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑林、鏈霉素、慶大霉素、氟哌酸、恩諾沙星、氟苯尼考、強力霉素、紅霉素、利福平、泰樂菌素、卡那霉素、土霉素、林可霉素、磺胺二甲嘧啶鈉。將分離純化的細(xì)菌涂布在含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的巧克力瓊脂培養(yǎng)基上,置于5% CO2 37 ℃培養(yǎng)箱,24 h后觀察并測量抑菌圈直徑,判定標(biāo)準(zhǔn)參考杭州微生物試劑有限公司說明書。endprint

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