王寶云，唐修俊，王達利

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義563000：2貴州省人民醫(yī)院)

不同時期增生性瘢痕組織中c-kit、PI3K的表達變化

王寶云1,2，唐修俊1，王達利1

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義563000：2貴州省人民醫(yī)院)

目的探討酪氨酸激酶受體(c-kit)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)在不同時期增生性瘢痕組織中的表達變化。方法臨床收集增生性瘢痕(HS)患者HS組織24例份，隨機分為6個月、12個月、24個月組，另選正常皮膚組織8例份作為對照組；行HE染色，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測 c-kit、PI3K mRNA表達水平，Western blotting法檢測c-kit和PI3K蛋白表達水平。結(jié)果正常皮膚組組織中c-kit mRNA呈高表達，PI3K mRNA呈低表達。不同時段HS組織中PI3K、c-kit的mRNA表達：隨時間延長HS組織中PI3K的mRNA表達由強變?nèi)?，早?6、12個月組)呈高表達，晚期(24個月組)降低;其6個月及12個月組高于正常組(P均<0 05)；c-kit mRNA表達量由弱變強，在HS早期(6個月組)同正常皮膚組織相比呈現(xiàn)低表達(P<0.05)，12個月組逐漸升高， 24個月組高于12個月組(P<0.05)，仍低于正常組(P均<0.05)。正常皮膚組織c-kit蛋白和PI3K 蛋白呈低表達。各組不同時間c-kit、PI3K 蛋白表達均高于正常組，12個月組與24個月組兩指標(biāo)比較,P均<0.05。結(jié)論不同時期HS組織中c-kit、PI3K mRNA和蛋白質(zhì)表達存在差異，除c-kit mRNA外，均高于正常皮膚組織。瘢痕增生明顯時c-kit、PI3K mRNA和蛋白質(zhì)表達增高，瘢痕穩(wěn)定時逐漸降低。

增生性瘢痕；酪氨酸激酶受體;磷脂酰肌醇(-3)激酶

增生性瘢痕(HS)是組織過度增生形成的一種病理性瘢痕，是一種人類特有的纖維增生性疾病。作為整形外科常見疾病，一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的難點和熱點。目前其發(fā)病機制仍不十分清楚。研究顯示[1]，干細(xì)胞因子(SCF)和c-kit通過參與成纖維細(xì)胞增殖過程調(diào)控傷口愈合。c-kit是由顯性白斑基因編碼的酪氨酸激酶受體，與 SCF 受體結(jié)合，激活酪氨酸激酶，發(fā)生自身磷酸化并通過下游信號分子Akt、PI3K、c-kit，促進黑色素細(xì)胞、生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等增殖與活化。c-kit還是SCF/c-kit系統(tǒng)下游信號傳導(dǎo)通路中重要信號分子，該通路對細(xì)胞的生存、增殖起重要作用。Mukhopadhyay等[2]研究發(fā)現(xiàn)，用酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼抑制阻斷瘢痕疙瘩中SCF/c-kit信號通路上酪氨酸激酶，下游c-kit表達減少，使其產(chǎn)物α平滑肌肌動蛋白表達降低，由此可推斷SCF/c-kit信號通路參與瘢痕的形成。c-kit 的蛋白產(chǎn)物 Akt激活后可啟動下游 PI3K/Akt 信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖[3]。因此，我們推測， SCF/c-kit 信號通路及其下游 PI3K/Akt通路也參與不同時期HS中瘢痕的形成。2011年1月～2014年12月，本課題通過收集6、12、24個月的HS組織, 檢測c-kit、PI3K mRNA和蛋白在各時期瘢痕中的表達，探討c-kit、PI3K是否參與HS形成，為HS的防治及靶向治療提供前期基礎(chǔ)研究理論。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科患者24例，男12例、女12例，年齡6～55歲、中位年齡34歲。瘢痕形成原因：胸前毛囊炎后HS 14例，燒傷后HS 6例，手術(shù)切口HS 4例。瘢痕組織無感染破潰，無其他腫瘤及器質(zhì)性病變，患者及家屬知情同意。選其6、12、24個月(6、12、24個月組)胸前及肩部未經(jīng)過藥物處理的HS組織，另收集8例健康無瘢痕體質(zhì)患者相應(yīng)部位正常皮膚組織作為對照組。健康無疤痕體質(zhì)患者男4例、女4例，年齡2～55歲。

1.2 標(biāo)本切取保存與HE染色 術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，取瘢痕組織后生理鹽水清洗，取瘢痕增生明顯位置黃豆大小兩塊組織，完全浸入盛有RNAiso Plus EP管和干燥EP管中轉(zhuǎn)移至實驗室，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。再?塊瘢痕組織用4%甲醛固定24 h，行病理學(xué)檢查。 HS組織行HE染色(制作過程：取材→固定→HS 標(biāo)本脫水透明→組織塊浸蠟包埋→蠟塊組織切片與貼片→脫蠟與染色→脫水與固定→顯微鏡下觀察拍照記錄保存圖片)。

1.3 瘢痕組織中c-kit和PI3K mRNA表達的檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取總RNA，并將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照試劑盒說明書進行PCR擴增。引物序列：c-kit：F：5′GGAAAGAAGACAACGACACGC3′(產(chǎn)物長度122 bp)；R：5′GGGGTCAGGAATAAACCTCAAGT3′(產(chǎn)物長度122 bp)；PI3K：F：5′GGTGACTGTGTGGGACTTATTGA3′(產(chǎn)物長度114 bp)；R：5′CTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA3′(產(chǎn)物長度114 bp)；β-actin：F：5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′(產(chǎn)物長度186 bp)；R：5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′(產(chǎn)物長度186 bp)。反應(yīng)條件：取反應(yīng)體系20 μL：SYBR PREMIX EX TAQⅡ(2×)10 μL，上下游混合引物1.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，59 ℃退火 30 s，共進行40個循環(huán)；從 55 ℃開始，每 0.5 ℃采集 1 次熒光，1 次/10 s,共采集 81 次。取PCR 產(chǎn)物5 μL，加入TAE 電泳緩沖液+1.5%的瓊脂糖凝膠，110 V、電泳20 min。PCR 結(jié)果的分析根據(jù)文獻[4]進行。目的基因表達量以2-ΔΔCT表示。

1．4 瘢痕組織中c-kit和PI3K 蛋白表達的檢測 采用Western blotting法。蛋白提取(取少量組織塊剪碎后置于5 mL勻漿器中加入RAPA(含 10 μL PMSF)試劑1 mL進行勻漿，操作均在冰上進行；將裂解物移至 1.5 μL離心管中，4 ℃離心 5 min；取上清即為樣品總蛋白)→蛋白含量測定(按照下表加樣用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)→SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳-轉(zhuǎn)膜(制作“三明治”)→ 封閉(將轉(zhuǎn)膜成功的 PVDF 膜置于 Western 封閉液中，水平搖床上封閉1 h)→ 一抗孵育與洗膜 →二抗孵育與洗膜→ECL 發(fā)光 → 曝光檢測。結(jié)果的數(shù)據(jù)處理：X 光片經(jīng)掃描儀掃描為圖片，利用圖像分析儀，檢測雜交帶上的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 HS組織HE染色結(jié)果 HS組織HE染色鏡下觀察：瘢痕深部膠原纖維增厚，表現(xiàn)為排列不規(guī)則，呈波瀾形或纏繞成繩索狀，正常皮膚中逐漸消失。12個月HS組織中成纖維細(xì)胞增多，以血管周圍及間質(zhì)中較多；24個月HS組織成纖維細(xì)胞有所減少，間質(zhì)中細(xì)胞數(shù)減少不明顯，膠原排列不規(guī)則，較12個月瘢痕組織稀松。

2.2 不同時期瘢痕組織中c-kit及PI3K mRNA和蛋白的表達變化 正常皮膚中c-kit mRNA呈高表達，PI3K mRNA呈低表達。不同時段HS組織中PI3K、c-kit的mRNA表達：隨著時間延長HS中PI3K的mRNA表達由強變?nèi)?，早?6、12個月組)呈高表達，晚期(24個月組)降低;其6個月及12個月組高于正常組(P均<0 05)；c-kit mRNA表達量由弱變強，在HS早期(6個月組)同正常皮膚組織相比呈現(xiàn)低表達(P<0.05)，12個月組逐漸升高， 24個月組高于12個月組(P<0.05)，仍低于正常組(P<0.05)。正常皮膚組織c-kit蛋白和PI3K 蛋白呈低表達。各組不同時間組c-kit、PI3K 蛋白表達均高于正常組，12個月組與24個月組兩指標(biāo)比較,P均<0.05。

表2 各組瘢痕組織中c-kit、PI3K mRNA和蛋白表達比較

3 討論

HS作為一種成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原過度沉積性疾病，其發(fā)生和發(fā)展可能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的異常表達有關(guān)。有研究證實，對HS早期異常表達的細(xì)胞周期相關(guān)基因進行干預(yù)，可有效控制HS發(fā)生和發(fā)展。但基因轉(zhuǎn)錄水平的研究只能在一定程度上反映基因表達產(chǎn)物的變化，真正發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控以及翻譯后加工等許多步驟調(diào)控才能形成[5]。在此過程中有許多因素會干擾遺傳信息的傳遞，如microRNA可沉默靶基因，抑制其蛋白的合成，但并不影響基因的mRNA表達數(shù)量[6]。而細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的功能，是通過動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來調(diào)控的，蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有很多種，不是每種修飾都在發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。因此有必要探討不同階段HS細(xì)胞周期相關(guān)基因、蛋白的表達以及反映蛋白功能執(zhí)行情況的一致性，為對HS進行細(xì)胞周期的干預(yù)或基因治療提供前期理論依據(jù)。

已有研究[7]證實，成纖維細(xì)胞是HS中的主要效應(yīng)細(xì)胞，瘢痕中成纖維細(xì)胞過度增生可能與細(xì)胞間的信號傳遞有關(guān)。研究顯示，SCF和c-kit在傷口愈合的過程中促進成纖維細(xì)胞增殖從而調(diào)控傷口愈合[8,9]。SCF/c-kit信號系統(tǒng)、PI3K/Akt信號通路參與細(xì)胞增殖，在腫瘤的生長發(fā)育中起重要作用。又有研究發(fā)現(xiàn)，Akt、PI3K、c-kit賦予造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖與活化[10,11]。前期研究表明,SCF/c-kit信號傳導(dǎo)通路通過PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→Cyclin D3→Rb→p42/p94完成細(xì)胞DNA合成信號的傳遞導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖[12],該通路對細(xì)胞的增殖分化起重要作用。細(xì)胞自身細(xì)胞因子如酪氨酸激酶生長因子、G蛋白、整合素及轉(zhuǎn)化生長因子β1均能激活SCF/c-kit信號通路下游信號PI3K/Akt通路，PI3K活化產(chǎn)生第二信使肌醇脂物質(zhì)，在PI(3，4，5)P3依賴性蛋白激酶1的輔助下激活A(yù)kt調(diào)控PI3K表達從而促進細(xì)胞的增殖與分化[13]。在正常皮膚組織中也有少量c-kit的表達。創(chuàng)面修復(fù)過程中SCF/c-kit信號通路激活，c-kit表達上調(diào)從而促進細(xì)胞的增殖與分化。研究顯示,在HS成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)中阻斷PI3K/Akt通路可使其下游產(chǎn)物表達減少，因此根據(jù)實驗結(jié)果初步可以推斷c-kit、PI3K參與HS形成，其表達變化與臨床HS的臨床表現(xiàn)相符合。

本實驗RT-PCR結(jié)果顯示,正常皮膚組織中c-kit的mRNA高于不同時期瘢痕組織中mRNA，可能與取材不是同一患者、個體差異、患者處于亞健康狀態(tài)等因素有關(guān)，目的基因并不全部翻譯出目的蛋白，對此現(xiàn)象在后續(xù)實驗中進一步證實。24個月組PI3K的mRNA表達低于6個月組。6個月組PI3K的mRNA表達高于12個月組可能與早期多種因子共同激活促進PI3K的表達有關(guān)。而Western blotting結(jié)果顯示,c-kit、PI3K蛋白表達12個月組高于6個月組，因此，我們推測PI3K、c-kit mRNA和蛋白的表達在6～24個月內(nèi)隨HS形成的時間呈動態(tài)變化，瘢痕處于增生期時，PI3K、c-kit mRNA和蛋白表達呈進行性增高，隨著瘢痕進入穩(wěn)定期后c-kit mRNA和蛋白的表達逐漸降低。其蛋白表達增高峰值與mRNA增高峰值不呈正相關(guān)，基因表達與蛋白翻譯不同步，可能與6個月組c-kit、PI3K的mRNA部分未翻譯為功能蛋白有關(guān)，也可能與多種因子無效刺激及翻譯出有效目的蛋白的mRNA數(shù)量較少有關(guān)。結(jié)合臨床表現(xiàn)12個月瘢痕已達高峰趨于穩(wěn)定，c-kit、PI3K mRNA表達逐漸降低；24個月組c-kit mRNA降低，PI3K mRNA明顯降低，與臨床瘢痕的變化相符合。

綜上所述，在不同時期HS組織中c-kit、PI3K mRNA和蛋白質(zhì)表達存在差異，在瘢痕增生高峰時期存高表達狀態(tài)，瘢痕穩(wěn)定時逐漸降低，這種差異性與HS的臨床變化相符合。在HS的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程中，可能存在基因沉默或基因丟失，但這些并未影響基因的最終產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達以及蛋白功能的執(zhí)行，即這兩個基因在HS的形成和發(fā)展過程中作用明顯，在HS早期對這兩個基因進行靶向干預(yù)，有可能會較好地控制HS的發(fā)生發(fā)展。

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貴州省科技廳資助項目[黔科合J字LKZ[2011]47號]。

唐修俊( E-mail：xiujunsszx@163.com)

2017-06-07)