仇慧仙 何躍娥 榮星

[摘要] 目的 通過檢測(cè)川崎病患兒血內(nèi)皮微粒、一氧化氮及炎癥因子水平，探討內(nèi)皮微粒在反映川崎病早期血管功能狀態(tài)作用及其影響因素。 方法 收集川崎病急性期患兒50例，同時(shí)收集性別、年齡相匹配的健康兒童20例，檢測(cè)血內(nèi)皮微粒、一氧化氮及炎癥因子水平，觀察內(nèi)皮微粒和川崎病冠狀動(dòng)脈損害及炎癥因子、一氧化氮水平間的關(guān)系。 結(jié)果 川崎病患兒血漿內(nèi)皮微粒含量明顯高于正常對(duì)照組，且有冠狀動(dòng)脈損害者升高水平更為明顯，與一氧化氮及炎癥因子腫瘤壞死因子-α、C-反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 川崎病患兒早期即存在EMPs的升高，與冠脈損害間呈正向關(guān)系，可反映川崎病患兒早期的血管功能狀態(tài)，且與炎癥因子及一氧化氮水平呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 川崎??；內(nèi)皮微粒；一氧化氮；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號(hào)] R725.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）28-0008-04

[Abstract] Objective To explore the role of endothelial microparticles in the vascular function of early Kawasaki disease and its influencing factors by detecting the levels of endothelial microparticles， nitric oxide and inflammatory factors in children with Kawasaki disease. Methods A totally of 50 children with acute Kawasaki disease were enrolled. 20 healthy children with matched gender and age were collected. The blood endothelial microparticles， nitric oxide and inflammatory factors were measured. The relationship between endothelial particles and Kawasaki disease coronary artery lesions， inflammatory factors and nitric oxide were observed. Results The plasma endothelial microparticles content of children with Kawasaki disease was significantly higher than that of the normal control group， and the elevated level of coronary artery lesions in the patients was more obvious， and positively correlated with the levels of nitric oxide， inflammatory factors tumor necrosis factor-α and C-reactive protein（P<0.05）. Conclusion The elevation of EMPs occurs in early Kawasaki disease and is positively correlated with coronary artery lesions， which can reflect the vascular function status of children with early Kawasaki disease and is positively correlated with inflammatory factors and nitric oxide levels.

[Key words] Kawasaki disease；Endothelial microparticles；Nitric oxide；Tumor necrosis factor-α

川崎?。↘awasaki disease，KD）是目前兒童最常見的獲得性心臟病之一，患兒的血管內(nèi)皮功能障礙及冠狀動(dòng)脈損害是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的第一步，也是成年后發(fā)生心血管疾病的潛在危險(xiǎn)因素[1]，而目前臨床缺乏簡(jiǎn)便可行的方法反映川崎病患兒的內(nèi)皮功能狀態(tài)。內(nèi)皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）是細(xì)胞在活化損傷或凋亡時(shí)從細(xì)胞表面脫落的小的膜性囊泡，是一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中直徑小于1 μm的微粒命名為EMPs，EMPs被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，川崎病患兒的血漿EMPs水平明顯升高，與冠狀動(dòng)脈損害呈正相關(guān)[3]。一氧化氮（nitric oxide，NO）在川崎病內(nèi)皮損害中起關(guān)鍵作用[4]。川崎病患兒內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致EMPs升高是否也與NO有關(guān)，目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)川崎病患兒血漿中EMPs、NO濃度及炎癥因子水平，觀察川崎病患兒中早期EMPs水平與川崎病冠狀動(dòng)脈損害、NO及炎癥反應(yīng)間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年6月～2016年6月在我院確診為川崎病組患兒50例，女17例，男33例，平均年齡（29.7±18.8）個(gè)月，入院時(shí)平均發(fā)熱時(shí)間（6.0±2.8）d，均符合2004 年美國兒科學(xué)會(huì)和心臟病學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選取同期性別、年齡匹配的健康兒童20例作為正常對(duì)照組，女7例，男13例，平均年齡（36.8±14.3）個(gè)月，兩組間性別構(gòu)成及年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.006，P=0.937，t=-1.71，P=0.094）。川崎病組50例患兒中，以病程1個(gè)月內(nèi)是否存在冠狀動(dòng)脈損害分成冠狀動(dòng)脈損害（coronary artery leision，CAL）組14例（28%）；冠狀動(dòng)脈無損害（no coronary artery leision，NCAL）組36例。

冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的診斷標(biāo)準(zhǔn)：年齡<3歲，冠狀動(dòng)脈直徑>2.5 mm；3歲≤年齡<9歲，冠狀動(dòng)脈直徑>3.0 mm，9歲≤年齡<14歲，冠狀動(dòng)脈直徑>3.5 mm。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)患兒血漿EMPs、NO及TNF-α含量 同時(shí)收集川崎病組患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，如患兒年齡、發(fā)熱時(shí)間（發(fā)熱開始至入院時(shí)的時(shí)間）、丙球使用時(shí)間（病程開始至丙球使用的時(shí)間間隔）、血白細(xì)胞（white blood cells，WBC）計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值（absolute neutrophil count，ANC），C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、有無冠脈損害。

1.2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定血漿內(nèi)皮微粒 所有患兒抽取靜脈血2 mL（川崎病患兒在靜脈丙球使用前），先后以160 g 離心10 min 和1 000 g 離心8 min獲取無血小板血漿。取50 μL無血小板血漿，加入4 μL PE 標(biāo)記的小鼠抗人CD31 單克隆抗體（mAb）和FITC 標(biāo)記的小鼠抗人CD42b mAb，室溫下避光孵育20 min；依次加入1 mL PBS 液和已知濃度的1.0 μm（用于前向角設(shè)門）和10.0 μm（用于計(jì)數(shù)參照） 標(biāo)準(zhǔn)微球混合液后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，定義EMP直徑<1.0 μm，收集10000個(gè)10.0 μm 標(biāo)準(zhǔn)微粒用于計(jì)數(shù)參照標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 硝酸還原法檢測(cè)血漿NO水平 于急性期清晨空腹取外周靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，2500 r/min，離心半徑15 cm，離心3 min后分離血漿和細(xì)胞，-70℃保存。采用硝酸還原法測(cè)定血漿NO 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血漿TNF-α含量 留取患兒血清標(biāo)本，采用ELISA法檢測(cè)血TNF-α含量，嚴(yán)格按試劑盒操作步驟進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（x±s）表示，多組間比較如符合正態(tài)性分布且方差齊，采用單因素方差分析并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，如不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用Kruska-Wallis 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用直線相關(guān)分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間血漿EMPs、NO及TNF-α水平比較

川崎?。↘D）組患兒血漿EMPs、NO及TNF-α水平均較正常對(duì)照組明顯升高，且冠脈損害組升高幅度更為明顯（P<0.05），見表1。

CAL組和NCAL組比較，CAL組白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、ESR、EMPs、NO及TNF-α水平較NCAL組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CAL組CRP水平較NCAL組高，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩組間患兒年齡、發(fā)熱時(shí)間及丙球使用時(shí)間無差異（P>0.05）。見表2。

2.2相關(guān)性分析

EMPs與NO、CRP、TNF-α間均呈正相關(guān)（r分別為0.336、0.397、0.614，P分別<0.01、0.004、<0.01），見圖1。

NO與白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)間呈正相關(guān)（r=0.383、0.467，P=0.006、0.001），見圖2。

3討論

川崎病是一種全身血管炎性疾病，其中冠狀動(dòng)脈損害是其嚴(yán)重并發(fā)癥之一[5]。急性期冠狀動(dòng)脈病變發(fā)生率可高達(dá)30%[6]，而冠狀動(dòng)脈病變及血管內(nèi)皮的持續(xù)損害是成年后冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的潛在危險(xiǎn)因素，但目前臨床缺乏有效的檢測(cè)血管內(nèi)皮的指標(biāo)。完整的血管內(nèi)皮屏障在調(diào)節(jié)血管功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要的作用，內(nèi)皮的激活或損傷導(dǎo)致多種因子紊亂，其中包括微粒的釋放。EMPs是內(nèi)皮細(xì)胞受到各種刺激后從細(xì)胞膜上脫落下來的一個(gè)亞細(xì)胞組分，被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)[7-9]，在炎癥、凝血及血管功能等方面均有一定的影響[10-13]。在一些內(nèi)皮功能受損的疾病如白塞氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中均存在EMPs不同程度的升高[14，15]。目前普遍認(rèn)為EMPs 的出現(xiàn)會(huì)形成惡性循環(huán)，即內(nèi)皮功能受損引起EMPs釋放增加，增加的EMPs反過來會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮功能不全，加重病情[16]。Tual-Chalot等[17]研究提示缺氧條件下產(chǎn)生的EMPs通過調(diào)節(jié)一氧化氮合酶的磷酸化水平，抑制了NO的合成，損傷內(nèi)皮舒張功能。研究發(fā)現(xiàn)KD患兒出現(xiàn)EMPs的升高，升高的EMPs對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響是否也和NO水平有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)50例急性期KD患兒及20例性別年齡相匹配的正常兒童的EMPs、NO含量及炎癥因子水平，探討其相關(guān)性。

結(jié)果顯示，KD患兒血漿EMPs水平較正常兒童明顯升高，而存在冠狀動(dòng)脈損害的KD患兒EMPs升高水平更為明顯。因KD為全身中小血管的炎癥，存在冠脈損害的患兒提示血管炎癥更為明顯，故EMPs升高得更為明顯。因而KD患兒早期EMPs明顯升高的患兒需高度警惕出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈損害可能，可能為冠狀動(dòng)脈損害的危險(xiǎn)因素之一。此外我們還發(fā)現(xiàn)，EMPs水平和炎癥因子CRP、TNF-α間呈正相關(guān)，提示炎癥反應(yīng)可加重內(nèi)皮功能損害從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放EMPs。

NO是體內(nèi)由L精氨酸在NO合酶作用下產(chǎn)生的一種氣體信號(hào)分子，生理?xiàng)l件下具有降血壓，抑制血小板黏附、聚集、抗血栓、抑制細(xì)胞的增生、保護(hù)細(xì)胞等作用，但高濃度NO可引起血管壁炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、內(nèi)膜增厚、管腔狹窄，與許多心血管疾病密切相關(guān)[18]。所以 NO 的作用是一種矛盾存在，具體的作用可能與其濃度、產(chǎn)生部位、作用的持續(xù)時(shí)間等因素有關(guān)[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，KD中存在誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及NO水平變化，在冠狀動(dòng)脈病變中發(fā)揮一定的作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD急性期患兒血漿NO含量明顯高于正常對(duì)照組，且冠狀動(dòng)脈損害組患兒升高水平更為明顯，與白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平呈正相關(guān)。急性期KD患兒外周血中NO表達(dá)上調(diào)，可能和中性粒細(xì)胞升高使一氧化氮合酶合成增加，從而使血漿NO水平升高，提示其可能參與KD早期炎癥性變化以及冠狀動(dòng)脈的損傷過程。

相關(guān)性分析顯示，KD患兒血EMPs水平與NO、CRP及TNF-α呈正相關(guān)，炎癥反應(yīng)越強(qiáng)烈，發(fā)生冠脈損害及血管內(nèi)皮功能損害的可能性越大，EMPs的含量越高。EMPs和NO兩者在川崎病的冠脈損害發(fā)病中發(fā)揮協(xié)同作用。另KD冠脈病變檢出率最高的是病程2～4周，本組資料KD患兒在平均病程為6 d時(shí)檢測(cè)EMPs，即在出現(xiàn)冠脈擴(kuò)張之前即可能存在血管功能異常，因此EMPs可作為KD患兒早期的血管功能狀態(tài)的判斷指標(biāo)。但本實(shí)驗(yàn)僅觀察了KD急性期患兒的血EMPs、NO水平變化及和炎癥因子間的關(guān)系，未對(duì)恢復(fù)期進(jìn)行分析，且EMPs和NO間具體的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步相關(guān)研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Erdbruegger U，Grossheim M，Hertel B，et al.Diagnostic role of endothelial microparticles in vasculitis[J]. Rheumatology （Oxford），2008，47（12）：1820-1825.

[2] Van Ierssel SH，Hoymans V，Van Craenenbroeck EM，et al.Endothelial microparticles（EMP） for the assessment of endothelial function：An in vitro and in vivo study on possible interference of plasma lipids[J]. PLo S One，2012， 7（2）：e31496-31498.

[3] Zhen Tan，Yam Yuan，Sun Chen，et al. Plasma endothelial microparticles，TNF-α and IL-6 in Kawasaki disease[J].Indian Pediatric，2013，50（5）：501-503.

[4] Shuko S，Hirokazu T，Naoko O，et al.Endothelial dysfunction in Kawasaki disease：Focus on nitric oxide[J].Pediatrics International，2004，46（2）：114.

[5] McCrindle BW，Rowley AH，Newburger JW，et al. Diagnosis，treatment，and long-term management of Kawasaki disease：A scientific statement for health professionals from the American Heart Association[J].Circulation，2017， 135（17）：e927-e999.

[6] 周芳，許君，賈黎紅，等.兒童川崎病冠狀動(dòng)脈病變危險(xiǎn)因素分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018，56（3）：56-59.

[7] Dieker J，Tel J，Pieterse E，et al. Circulating apoptotic microparticles in systemic lupus erythematosus patients drive the activation of dendritic cell subsets and prime neutrophils for NETosis[J]. Arthritis Rheumatol，2016，68（2）：462-472.

[8] Li P，Qin C. Elevated circulating VE-cadherin+CD144+ endothelial microparticles in ischemic cerebrovascular disease[J]. Thromb Res，2015，135（2）：375-381.

[9] Jaffer FA，Calfon MA，Rosenthal A，et al.Two dimensional intravascular near-infrared. Fluorescence molecular imaging of inflammation in atherosclerosis and stent-induced vascular injury[J].J Am Coll Cardiol，2011，57（25）：2516-2526.

[10] Peiffer V，Bharath AA，Sherwin SJ，et al. A novel method for quantifying spatial correlations between patterns of atherosclerosis and hemodynamic factors[J]. J Biomech Eng， 2013，135（2）：21-23.

[11] Camargo LM，F(xiàn)ranca CN，Izar MC，et al. Effects of simvastatin/ezetimibe on microparticles，endothelial progenitor cells and platelet aggregation in subjects with coronary heart disease under antiplatelet therapy[J]. Braz J Med Biol Res，2014，47（5）：432-437.

[12] Muller O，Bartunek J，Hamilos M. Von Willebrand factor inhibition improves endothelial function in patients with stable angina[J]. J Cardiovasc Transl Res，2013，6（3）：364-370.

[13] Curtis AM，Edelbeig J，Jonas R，et al. Endothelial microparticles：Sophisticated vesicles modulating vascular fimctioa [J].Vase Med，2013，18（4）：204-214.

[14] Hussein MNA，Meesters EW，Osmanovic N，et al.Antigenic characterization of endothelial cell-derived microparticles and their detection exvivo[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis，2003，11（11）：2434-2443.

[15] Melikoglu M，Topkarci Z.Is there a relation between clinical disease activity and acute phase response in Behcets disease？[J].Int J Dermatol，2014，53（2）：250-254.

[16] Priou P，Gaqnadoux F，Tesse A，et al.Endothelial dysfuntion and circulating microparticles from patients with obstructive sleep apnea[J].Am J Pathol，2010，177（2）：974-983.

[17] Tual-Chalot S，Guibert C，Muller B，et al.Circulating microparticles from pulmonary hypertensive rats induce endothelial dysfunction[J].Am J Respir Crit Care Med，2010， 182（2）：261-268.

[18] Li XH，Zhang CY，Wu JX，et al. Changes in plasma hydrogen sulfide and nitric oxide levels and their clinical significance in children with Kawasaki disease[J].Chin Med J，2011，124（21）：3445-3449.

[19] Yetik-Anacak G，Catravas JD.Nitric oxide and the endothelium：History and impact on cardiovascular disease[J].Vascul Pharmucol，2006，45（5）：268-276.

[20] 盧亞亨，張 靜，易豈建，等.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與川崎病并發(fā)冠狀動(dòng)脈病變易感性研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，38（3）：269-274.

（收稿日期：2018-06-01）