何東明++++++陸永光+++++唐真武+++++藍(lán)子深++++++劉秋霞

[摘要] 目的 分析廣西地區(qū)漢族人群瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRVP1）基因多態(tài)性及基因型和單倍型特點(diǎn)，為研究TRVP1與疾病的關(guān)系提供依據(jù)。 方法 采用單堿基延伸的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)和 DNA 測(cè)序法，檢測(cè)207例健康廣西漢族人TRVP1基因多態(tài)性，分析廣西人群4個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布頻率，并與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）公布的其他人群基因多態(tài)性分型數(shù)據(jù)比較。 結(jié)果 廣西漢族人群TRPV1基因rs222747、rs224534、rs4790522和rs8065080位點(diǎn)各具有3種基因型。與人類基因組計(jì)劃公布的歐洲人群、非洲人群、日本人群和北京漢族人群的單核苷酸多態(tài)性分型數(shù)據(jù)相比，廣西漢族人群TRPV1基因不同多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與其他地區(qū)人群的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 廣西漢族人群中存在TRVP1基因多態(tài)性，多態(tài)性的分布頻率與其他地區(qū)人群比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

[關(guān)鍵詞] 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1；基因多態(tài)性；廣西；漢族

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）32-0001-04

[Abstract] Objective To analyze the polymorphism of transient receptor potential vanillic acid subtype 1， genotype and haplotype in the population of Guangxi Han population， and to provide the basis for studying the relationship between TRVP1 and and diseases. Methods The polymorphism of TRVP1 gene in 207 healthy Guangxi Han Chinese were detected by polymerase chain reaction（PCR） extended by single base and DNA sequencing. The genotype of 4 loci and the frequency of allele distribution in Guangxi population were analyzed and compared with the gene polymorphism data of other populations published by the National Center for Biotechnology Information（NCBI）. Results There were three genotypes respectively in rs222747， rs224534， rs4790522 and rs8065080 loci of TRPV1 gene in Guangxi Han population. There were significant differences（P<0.05） in genotype and allele frequencies of different polymorphic loci of TRPV1 gene between the Guangxi Han population and those in other regions， compared with the single nucleotide polymorphism typing data of European population， the African population， the Japanese population and the Beijing Han population published in human genome project. Conclusion There are TRVP1 gene polymorphisms in Guangxi Han population， and there is significant difference in the distribution of polymorphism between the Guangxi Han population and the rest of the population.

[Key words] Transient receptor potential vanillic acid subtype 1； Gene polymorphism； Guangxi； Han nationality

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential family vanilloid subtype 1，TRPV1），又稱辣椒素受體（vanilloid receptor subtype1，VR1），屬于瞬時(shí)感受器電位家族成員之一，是一個(gè)非選擇性配體門控陽離子通道[1]。TRPV1可被辣椒素（capsaicin，CAP）、多種內(nèi)源性配體及酸、熱等刺激因素激活，釋放多種神經(jīng)活性肽，進(jìn)而參與痛覺整合、心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗腫瘤等生理和病理生理過程[2，3]。TRPV1 基因位于人類 17p13 染色體，多個(gè)位點(diǎn)存在非同義單核苷酸多態(tài)性[4]。目前國內(nèi)外已有研究證實(shí)，TRPV1基因多態(tài)性與多種疾病密切相關(guān)，且基因多態(tài)性在不同民族間存在差異[5]。本研究通過探究TRPV1 基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西漢族人群中的分布，并與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）-HapMap公布的歐洲人群（CEU）、非洲人群（YRI）、日本人群（JPT）及北京漢族人群（HCB）進(jìn)行比較，為研究該基因在不同族群中的分布差異，探索疾病在不同人群中的遺傳規(guī)律提供理論依據(jù)。endprint

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年4月～2015年8月欽州市第二人民醫(yī)院正常體檢者，實(shí)驗(yàn)室檢查正常，排除心腦血管疾病及重要臟器疾病者。所有的研究對(duì)象均為廣西漢族人群，彼此之間無血緣關(guān)系，并且簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）廣西漢族人群；（2）年齡≥18歲；（3）自愿加入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）智力、聽力、肢體活動(dòng)明顯障礙，不易配合者；（2）合并嚴(yán)重疾病，預(yù)期壽命<1年者；（3）不愿加入本研究項(xiàng)目者。本研究采用方便抽樣，共調(diào)查正常體檢者207例，其中男156例，女51例，年齡22～67歲，平均年齡（33.31±10.72）歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA 提取 研究對(duì)象均用采血管采集靜脈血10 mL，按標(biāo)準(zhǔn)方法在1 h內(nèi)離心，分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞至兩個(gè)1.5 mL塑料管中，-80 ℃冰箱中保存。使用成品化試劑盒，提取血樣、組織、細(xì)胞、唾液中的DNA。使用Nano Drop 2000儀器進(jìn)行OD值檢測(cè)，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA質(zhì)檢合格，轉(zhuǎn)移至96孔板，置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上查找的TRVP1 基因rs222747C/G、rs224534A/G、rs4790522A/C及rs8065080 C/T序列，選擇包含位點(diǎn)的序列并輸入sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design 3.1設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物合成。4個(gè)位點(diǎn)的上下游引物和延伸引物分別為：5'-ACGTTGGATGTTCTTGTTGGTGAGCTCCTC-3'、5'-ACGTTGGATGACACGAAGTTT- GTGACGAGC-3'、5'-AGCATGTACAATGAGATTCTGAT-3'，5'-ACGTTGGATGACAGCCTCCCTTTAAGA- TGG-3'、5'-ACGTTGGATGAGACTCCTCCTAACACAGAC-3'、5'-tTAACTCGGAAATAGTCTCCA-3'，5'-ACGTTGGATGATGTCCCAGTAGAGACTGAC-3'、5'-ACGTTGGATGCCCCAAGTGAATCTCCTAAC-3'、5'-TTTTTACTCACTTTACTAAACAGT-3'，5'-ACGTTGGATGATGATCCTGAGAGACCTGTG-3'、5'-ACGTTGGATGGACCAAGCTCATTACCTGTG-3'、5'-aaCCGAACAAGAAGACGA-3'。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 取1.5 mL EP管中配置PCR master mix，振蕩低速離心。每個(gè)加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL模板DNA（20 ng/μL）混勻，啟動(dòng)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）處理，以去除體系中游離的dNTPs。在新1.5 mL EP管中配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。采用Mass ARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384-well Spectro CHIP bioarray上，使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，并檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)測(cè)序的結(jié)果直接計(jì)算出基因型和等位基因的頻率；通過SHEsisPL在線平臺(tái)（http：//shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html）進(jìn)行Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢驗(yàn)。對(duì)符合H-W平衡的位點(diǎn)，比較廣西人群與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的4組人群（歐洲人群、非洲人群、日本人群及北京漢族人群） TRVP1 基因型及等位基因頻率差異，采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPV1基因型檢測(cè)結(jié)果

rs222747位點(diǎn)共有CC、CG、GG等3種基因型，基因型頻率分別為34.78%、50.72%和14.49%，C/G等位基因型頻率分別為60.14%和39.86%；rs224534位點(diǎn)共有AA、AG、GG等3種基因型，基因型頻率分別為60.39%、37.20%和2.42%，A/G等位基因型頻率分別為78.99%和21.01%；rs4790522位點(diǎn)共有AA、AC、CC等3種基因型，基因型頻率分別為7.73%、44.44%和47.83%，A/C等位基因型頻率分別為29.95%和70.05%；rs8065080位點(diǎn)共有CC、CT、TT等3種基因型，基因型頻率分別為34.78%、49.76%和15.46%，A/G等位基因型頻率分別為59.66%和40.34%。

2.2 不同人群間TRPV1基因多態(tài)性比較

rs222747位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西漢族人群和歐洲人群、非洲人群、日本人群、北京漢族人群中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），廣西漢族人群雜合子（C/G）基因型頻率高于歐洲、非洲人群但低于日本和北京漢族人群，C等位基因頻率低于歐洲、非洲人群但高于日本和北京漢族人群；rs224534位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西漢族人群和歐洲人群、非洲人群中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），廣西漢族人群雜合子基因型頻率（A/G）高于非洲人群但低于歐洲、日本和北京漢族人群，A等位基因頻率低于日本和北京漢族人群但高于歐洲、非洲人群；rs4790522位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西漢族人群和歐洲人群、非洲人群中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），廣西漢族人群雜合子基因型頻率（A/G）低于非洲、歐洲、日本和北京漢族人群，A等位基因頻率低于非洲和北京漢族人群但高于歐洲、日本人群；rs8065080位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西漢族人群和歐洲人群、非洲人群、日本人群中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 廣西漢族人群雜合子基因型頻率（A/C）高于非洲人、歐洲、日本和北京漢族人群，A等位基因頻率低于日本和北京漢族人群但高于歐洲、非洲人群。見表1～4。endprint

3 討論

目前文獻(xiàn)已報(bào)道的TRPV1基因多態(tài)性位點(diǎn)主要有rs222747、rs224534、rs4790522和 rs8065080[5，6]。rs222747、rs4790522位點(diǎn)的多態(tài)性與兒童哮喘和特異性咳嗽相關(guān)[5，7]；rs224534與痛覺相關(guān)[8]；rs8065080位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響個(gè)體對(duì)腸易激綜合征的遺傳易感性[9]，并與膝關(guān)節(jié)炎相關(guān)[10]。研究不同人群間 TRPV1 基因多態(tài)性及其分布，可為不同人群TRPV1基因多態(tài)性與特定疾病的遺傳易感性提供理論依據(jù)。本研究樣本的TRPV1基因的基因型和等位基因頻率符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有較好的群體代表性。

本研究發(fā)現(xiàn)廣西漢族人群與歐洲人群、非洲人群在rs222747、rs224534、rs4790522和 rs806508等4位點(diǎn)多態(tài)性分布上均有差異（P<0.05）；廣西漢族人群與日本人群在rs222747和 rs806508等2位點(diǎn)多態(tài)性分布上存在差異（P<0.05）；廣西漢族人群與北京漢族人群的rs222747位點(diǎn)多態(tài)性分布上存在差異（P<0.05）。研究結(jié)果表明，廣西漢族人群與北京漢族人群、日本人群多態(tài)性分布相近，與歐洲、 非洲人群多態(tài)性分布差異較大，表明親緣關(guān)系越近，基因型的分布差異越小，符合遺傳定律。

基因多態(tài)性分布與種族、地理環(huán)境、 飲食習(xí)慣及生活方式等多種因素相關(guān)[11，12]。廣西為多民族聚集地，地理環(huán)境、飲食習(xí)慣及生活方式獨(dú)具特色，這些因素都可能影響廣西漢族人群的基因多態(tài)性。多項(xiàng)研究證實(shí)，廣西人群的多個(gè)基因位點(diǎn)與其他種族、地區(qū)人群存在不同程度的差異[13-15]。這種差異可能是導(dǎo)致疾病在不同種族人群間的發(fā)病率不同的原因之一，對(duì)群體遺傳學(xué)及人類學(xué)的研究可能起非常重要的作用。

綜上所述，分析我國廣西漢族人群TRPV1基因rs222747、rs224534、rs4790522和 rs8065080位點(diǎn)的多態(tài)性及其在不同地區(qū)人群中的分布差異，有助于加深對(duì)群體遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí)，闡明基因與疾病的聯(lián)系，為研究TRPV1基因相關(guān)的特定疾病提供了線索，為基因檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Pan HL. Sensing Tissue Ischemia：Another new function for capsaicin receptors？[J]. Circulation，2004，110（13）：1826-1831.

[2] 張莉莉，馬麗群，祝之明. 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）在心血管系統(tǒng)中的作用[J]. 中國分子心臟病學(xué)雜志，2007，7（1）：51-53.

[3] 鄭潔，黨彤. 生活方式及飲食習(xí)慣對(duì)腸易激綜合征的影響[J].中國臨床新醫(yī)學(xué)，2016，9（4）：301-304.

[4] Szallasi A，Blumberg P. Vanilloid （Capsaicin） receptors and mechanisms[J]. Pharmacol Rev，1999，51（2）：159-212.

[5] 王強(qiáng)，白雪濤，徐東剛，等. TRPV1 UTR-3基因多態(tài)性與北京漢族兒童哮喘的易感性研究[J]. 衛(wèi)生研究，2009，38（5）：516-521.

[6] Xu GY，Winston JH，Shenoy M，et al. Transient receptor potential vanilloid 1 mediates hyperalgesia and is up-regulated in rats with chronic pancreatitis[J]. Gastroenterology，2007，133（4）：1282-1292.

[7] 張小寧，楊娟，羅征秀，等. 兒童非特異性慢性咳嗽病因及與TRPV1基因多態(tài)性的關(guān)系[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志，2012，14（7）：524-528.

[8] Van Esch A，Lamberts M，Te Morsche R，et al. Polymorphisms in gene encoding TRPV1-receptor involved in pain perception are unrelated to chronic pancreatitis[J]. BMC Gastroenterol，2009，9（1）：97-103.

[9] 張志強(qiáng).辣椒素受體基因多態(tài)性與腸易激綜合征的相關(guān)性[D].蘭州大學(xué)，2010.

[10] Valdes A，De Wilde G，Doherty S，et al. The Ile585Val TRPV1 variant is involved in risk of painful knee osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis，2011，70（9）：1556-1561.

[11] 羅曼，王進(jìn)，李桂冰，等.廣西地區(qū)正常人群SCA3/MJD基因多態(tài)性研究[J].中國臨床新醫(yī)學(xué)，2012，5（3）：210-211.

[12] 向陽，郭靜，藍(lán)艷，等. 精氨酸加壓素基因多態(tài)性在廣西人群中的分布[J].解剖學(xué)報(bào)，2016，47（4）：528-533.

[13] 黃華佗，王榮，陸玉蘭，等.白細(xì)胞介素17A基因rs3748067位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在廣西人群中的分布特點(diǎn)[J]. 右江醫(yī)學(xué)，2017，45（4）：389-393.

[14] 向陽，郭靜，彭友帆，等. IL-16基因23核苷酸插入/缺失在廣西人群中的分布[J].免疫學(xué)雜志，2016，32（9）：825-828.

[15] 陳健明，吳成將，藍(lán)艷，等. CD40L基因rs3092921G/A和rs3092933G/A位點(diǎn)多態(tài)性在廣西壯族和漢族人群中的分布[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42（19）：3551-3554.

（收稿日期：2017-08-22）endprint