肖仁順，阮 宏，蔣星海，吳 凱，王曉梅，宋玉林

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南昌 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰環(huán)兩親性肽自組裝凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相容性研究*

肖仁順，阮 宏，蔣星海，吳 凱，王曉梅，宋玉林△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南昌 330006)

目的分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與兩親性肽三維凝膠的相容性。方法取3周齡SD健康大鼠3只，分離股骨、脛骨獲取BMSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原；將10 mg/mL含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(RGD)環(huán)兩親性肽溶液加入等體積 DMEM/F12培養(yǎng)基數(shù)秒后自組裝成三維凝膠,透射電鏡顯微鏡(TEM)下觀察三維凝膠結(jié)構(gòu)；1×106cells/mL BMSCs懸液與RGD環(huán)兩性親肽混合形成三維培養(yǎng)體系，1×106cells/mL BMSCs懸液與多聚賴氨酸混合形成二維培養(yǎng)體系，無(wú)血清培養(yǎng)；CCK-8法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，鈣黃綠素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(PI)雙標(biāo)染色，熒光顯微鏡觀察RGD環(huán)兩性親肽對(duì)BMSCs增殖的影響。結(jié)果分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)或低表達(dá)CD34、CD45；TEM顯示凝膠由多空納米纖維構(gòu)成，納米纖維直徑2～5 nm，長(zhǎng)度100～1 000 nm；質(zhì)譜測(cè)得合成多肽相對(duì)分子質(zhì)量為1 256.37，與理論值一致；高效液相色譜分析兩性親肽純度為95.88%；鈣黃綠素乙酰氧基甲酯/PI雙標(biāo)染色顯示，三維培養(yǎng)體系中，30 min后少數(shù)BMSCs出現(xiàn)死亡，12 h后細(xì)胞開(kāi)始增殖，增殖較二維培養(yǎng)活躍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，三維培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖活力高于二維培養(yǎng)體系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RGD兩性親肽與BMSCs有良好的生物相容性，可能成為組織工程支架材料。

精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰；間質(zhì)干細(xì)胞；兩親性肽；細(xì)胞相容性

材料的生物相容性和細(xì)胞親和性可以通過(guò)固定的某些生物活性分子在聚合物或生物材料表面改進(jìn)，為種子細(xì)胞黏附、增殖、擴(kuò)展和分化提供良好的界面，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)，是構(gòu)建組織工程產(chǎn)品的重要措施。組織工程的快速發(fā)展,給神經(jīng)組織修復(fù)和再生帶來(lái)新的希望。組織工程的三要素為支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子，其中神經(jīng)支架材料用以恢復(fù)神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、分化、增殖，并提供足夠大的表面積和容積，從而達(dá)到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的支持、營(yíng)養(yǎng)作用，最終有利于血管的生成。支架最佳生長(zhǎng)模型具有很高的生物相容性和生物降解性，易于細(xì)胞附著、生長(zhǎng)，以及及時(shí)地?cái)z入營(yíng)養(yǎng)和排出廢物[1]。自組裝肽納米纖維支架高度模擬細(xì)胞外基質(zhì)并支撐細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)具有良好的生物相容性，已成為神經(jīng)組織工程材料的首要選擇[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化的潛能、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，成為神經(jīng)組織工程理想的種子細(xì)胞[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)與合成精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)環(huán)兩性親肽，自組裝形成多孔三維兩性親肽凝膠支架，研究SD大鼠BMSCs與含RGD環(huán)兩性親肽的相容性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康3周齡SD大鼠3只，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要儀器與試劑 RGD環(huán)兩性親肽結(jié)構(gòu)分子式為C16H31OA3G4D2RGD，委托上海波肽公司合成，用高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀進(jìn)行純化和分析，相對(duì)分子質(zhì)量為1 256.37，純度為95.88%。DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、B27(美國(guó)Gibco-BRL公司)，碘化丙啶(PI)，鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(美國(guó)Invitrogen 公司)，CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本DOjindo公司)。0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)、0.1 mol/L鹽酸(HCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，兔抗大鼠CD29、CD45、CD90多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)。倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(日本Olymous公司)，JEM-1230型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),細(xì)胞培養(yǎng)孵培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1BMSCs分離獲取 腹腔注射麻醉后脊髓脫臼處死大鼠，放入75%乙醇浸泡30 min，無(wú)菌環(huán)境下去除股骨、脛骨上的肌肉組織，取出股骨及脛骨，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，剪刀剪去股骨及脛骨兩端骨骺，用5 mL注射器吸入含20 μg/L bFGF、20 μg/L EGF、 2% B27的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,直到骨髓腔變白，將沖洗液移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%二氧化氮(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后僅將瓶子中培養(yǎng)液倒出更換新鮮培養(yǎng)液，不用PBS清洗瓶底。之后每隔2天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%以上，加入胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞第3代進(jìn)行細(xì)胞流式分析。

1.2.2BMSCs表面抗原流式鑒定 取培養(yǎng)至第3代的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后加入等體積含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min后去除培養(yǎng)基。加入少量PBS 后用移液管均勻吹打，將細(xì)胞水平調(diào)整至 1×109cells/L。取1 mL 1×109cells/L細(xì)胞懸液分別移入4支流式管中，PBS清洗細(xì)胞懸浮液2遍，再加入緩沖液重懸。每管分別加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的單克隆抗體5 μL，同型非特異性IgG-PE為陰性對(duì)照，避光室溫反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.3RGD環(huán)兩性親肽自組裝制備 取10 mg RGD環(huán)兩性親肽放入2 mL小管，加入0.1 mol/L NaOH溶液400 μL充分振蕩混勻溶解，加入400 μL無(wú)菌雙蒸水，再以每次滴加0.1 mol/L HCl 10 μL的方式緩慢調(diào)節(jié)多肽溶液至pH 8，繼續(xù)滴入無(wú)菌雙蒸水至體積為1 ml，此時(shí)多肽濃度為10 mg/mL，多肽溶液呈黏稠狀態(tài)。取200 μL黏稠狀多肽溶液滴入等體積含鈣離子(Ca2+)等二價(jià)陽(yáng)離子無(wú)酚紅的DMEM/F12自組裝成凝膠。取10 μL兩性親肽凝膠滴入金屬網(wǎng)格中，脫水，晾干，磷鎢酸染色,進(jìn)行透射電鏡顯微鏡(TEM)觀察。

1.2.4RGD環(huán)兩性親肽凝膠與BMSCs的復(fù)合性培養(yǎng) 將蓋玻片放入24孔板內(nèi)，取10 mg/mL RGD兩性親肽溶液200 μL滴加到蓋玻片，包被蓋玻片，將培養(yǎng)至第3代密度為 1×106cells/mL的BMSCs等體積接種于RGD環(huán)兩性親肽包被的蓋玻片上，數(shù)秒后形成三維凝膠細(xì)胞體系；凝膠內(nèi)部pH值為7.35，將凝膠細(xì)胞培養(yǎng)體系置于37 ℃ 5% CO2孵箱中無(wú)血清培養(yǎng)，取200 μL密度為1×106cells/mL的BMSCs懸液滴在多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37 ℃ 5% CO2孵箱中無(wú)血清培養(yǎng)(二維培養(yǎng)體系)。培養(yǎng)6、12、24 h的蓋玻片以PBS清洗3次，在蓋玻片上滴入配好的終濃度為2 μmol/L的鈣黃綠素乙酰氧基甲酯，終濃度為4 μmol/L的PI，37 ℃孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察黃綠色的活細(xì)胞，紅色的死細(xì)胞。

1.2.5RGD環(huán)肽對(duì)BMSCs增殖/毒性的作用 取96孔板，將1×105cells/mL BMSCs懸液100 μL接種于96孔板中，10 mg/mL環(huán)肽溶液100 μL加入40孔(三維細(xì)胞培養(yǎng)體系)，每組8孔；10 mg/mL環(huán)肽溶液100 μL加入余下的40孔(二維細(xì)胞培養(yǎng)體系)，每組8孔，每天分別向三維細(xì)胞培養(yǎng)體系1組8孔和二維細(xì)胞培養(yǎng)體系1組8孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光置于37 ℃、5% CO2孵箱2 h，調(diào)整到460 nm上機(jī)測(cè)量吸光度值(A值)，連續(xù)測(cè)量5 d。計(jì)算每天每組A值的平均數(shù)，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制BMSCs的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1倒置顯微鏡觀察原代BMSCs形態(tài)及生長(zhǎng)情況 沖洗骨髓腔出來(lái)的細(xì)胞，在第2、3天BMSCs開(kāi)始貼壁，細(xì)胞兩端成梭形，細(xì)胞核成卵圓形，細(xì)胞生長(zhǎng)呈克隆式，細(xì)胞呈大小不一放射狀的集落，開(kāi)始生長(zhǎng)較慢，2周左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%以上，細(xì)胞呈漩渦式、魚(yú)狀排列，胰酶消化后細(xì)胞貼壁均勻生長(zhǎng)，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，傳代后3 d左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，見(jiàn)圖1。

A：原代第6天BMSCs；B：第2代BMSCs；C：第3代BMSCs

圖1 BMSCs原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞(×100)

A：CD29；B：CD34；C：CD45；D：CD90

圖2 BMSCs流式細(xì)胞檢測(cè)

2.2BMSCs流式細(xì)胞鑒定 選取第3代BMSCs與CD29、CD34、CD45、CD90抗體結(jié)合后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示BMSCs高表達(dá)CD29(陽(yáng)性率為99.88%)、CD90(陽(yáng)性率為99.88%),不表達(dá)或低表達(dá)CD34(陽(yáng)性率為1.64%)、CD45(陽(yáng)性率為1.59%)，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs，見(jiàn)圖2。

2.3兩性親肽RGD環(huán)肽自組裝成凝膠納米支架 10 mg RGD環(huán)兩性親肽溶于400 μL 0.1 mol/L NAOH，加入400 μL雙蒸水，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 8，繼續(xù)加入雙蒸水至1 mL，此時(shí)肽溶液為黏稠狀態(tài)，加入等體積的無(wú)酚紅DEME/F12，數(shù)秒后成凝膠狀態(tài),TEM觀察凝膠由納米纖維構(gòu)成，納米纖維直徑 2～5 nm，長(zhǎng)度 100～1 000 nm，納米纖維相互交織成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

A：2 mL小管瓶口倒置，凝膠緊貼瓶底，凝膠有較強(qiáng)的黏附力；B：TEM下觀察凝膠由納米纖維交叉編織，納米纖維之間存在間隙

圖3兩性親肽RGD環(huán)肽自組裝成凝膠納米支架

2.4RGD環(huán)兩性親肽的檢測(cè)結(jié)果 質(zhì)譜結(jié)果顯示，RGD環(huán)兩性親肽相對(duì)分子質(zhì)量為1256.0，與目標(biāo)肽相對(duì)分子質(zhì)量的理論設(shè)計(jì)一致(圖4A)；高效液相色譜分析顯示，合成的RGD環(huán)兩性親肽純度為95.88%(圖4B、C)，表明合成的RGD環(huán)兩性親肽是本研究的目標(biāo)肽。

A：質(zhì)譜檢測(cè)合成目標(biāo)肽相對(duì)分子質(zhì)量為1256.0；B、C：高效液相色譜檢測(cè)合成目標(biāo)肽的純度為95.88%，已達(dá)到目標(biāo)肽濃度

圖4 RGD環(huán)兩性親肽的檢測(cè)結(jié)果

2.5RGD環(huán)兩性親肽納米凝膠與BMSCs復(fù)合性培養(yǎng)結(jié)果 細(xì)胞分別在二維培養(yǎng)體系與三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)6、12、24 h后分別進(jìn)行鈣黃綠素乙酰氧基甲酯和PI染色，細(xì)胞點(diǎn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間增加三維細(xì)胞培養(yǎng)體系活細(xì)胞數(shù)明顯比二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中6、12、24 h活細(xì)胞數(shù)，見(jiàn)圖5A、B、C；二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中6、12、24 h活細(xì)胞數(shù)，見(jiàn)圖5D、E、F；三維細(xì)胞培養(yǎng)體系死細(xì)胞(圖6A、B、C)與二維細(xì)胞培養(yǎng)體系死細(xì)胞(圖6D、E、F)未見(jiàn)增多。

2.6CCK-8測(cè)量?jī)尚噪膶?duì)BMSCs增殖的影響 BMSCs在三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中增殖曲線與在二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中增殖曲線見(jiàn)圖7，在三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中BMSCs增殖速度比在二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中BMSCs增殖速度快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A、B、C：三維細(xì)胞培養(yǎng)體系； D、E、F：二維細(xì)胞培養(yǎng)體系

圖5三維與二維細(xì)胞培養(yǎng)體系活細(xì)胞

A、B、C：三維細(xì)胞培養(yǎng)體系； D、E、F：二維細(xì)胞培養(yǎng)體系

圖6三維與二維細(xì)胞培養(yǎng)體系死細(xì)胞

圖7 兩性肽對(duì)BMSCs增殖的影響

3 討 論

脊髓損傷主要為機(jī)械直接對(duì)脊髓造成的傷害，通常導(dǎo)致完全或不完全的神經(jīng)功能喪失，如運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能喪失[4]。脊髓損傷給患者帶來(lái)心理和生理傷害，造成家庭巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，迫切需要尋求一種有效的治療脊髓損傷的方法。目前，神經(jīng)組織工程是治療脊髓損傷的有效方法。

生物材料包括有機(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、金屬材料三大類。由于無(wú)機(jī)材料及金屬材料具有硬度大、韌性低、彈性差、可塑性差等特點(diǎn)，不適合用于神經(jīng)組織工程；有機(jī)高分子材料具有在體內(nèi)不易降解，或降解產(chǎn)物不能被機(jī)體利用且難以清除，以及其生物相容性差等缺點(diǎn)，也不宜作為神經(jīng)組織工程的支架材料。利用兩親性肽自組裝構(gòu)建神經(jīng)組織工程支架是較好的方法，其基本原理：肽分子在酸或細(xì)胞培養(yǎng)液(含鈣、鎂或氫等離子)作用下,通過(guò)分子內(nèi)非共價(jià)鍵(氫鍵、疏水鍵、范德華力)等,自組裝為三維多孔納米纖維凝膠,形成納米纖維直徑較小,凝膠黏彈性可調(diào)控到與脊髓黏彈性一致,生物相容性好，降解產(chǎn)物為氨基酸可被細(xì)胞利用。這種肽在細(xì)胞培養(yǎng)液促發(fā)下可自組裝為納米纖維凝膠，反應(yīng)溫和，條件簡(jiǎn)單，與其他材料相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，是構(gòu)建神經(jīng)組織工程較好的基質(zhì)支架材料。

目前許多研究者通過(guò)改變氨基酸序列，設(shè)計(jì)出具有特定功能的肽鏈[5]，可模擬培養(yǎng)細(xì)胞所需要的生存環(huán)境，通過(guò)改變肽鏈的長(zhǎng)短序列及帶電性質(zhì)，在pH 7.35～7.45發(fā)生自組裝成多肽納米凝膠結(jié)構(gòu)，此納米凝膠與細(xì)胞外基質(zhì)相類似。由于多肽凝膠含水量較高且存在著間隙，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞排泄物的運(yùn)送提供了通道。多肽由天然的氨基酸合成，在體內(nèi)不會(huì)進(jìn)行排斥反應(yīng)和炎性反應(yīng)，凝膠在體內(nèi)酶的作用下降解，給細(xì)胞提供生存養(yǎng)料。RGD環(huán)肽序列為C16H31OA3G4D2RGD，環(huán)肽具有的特性為：(1)C16H31O序列提高對(duì)酸的敏感度，同時(shí)烷基尾可以調(diào)節(jié)納米纖維之間的間隙[6-7]；(2)A3G4(AAAGGGG)與C16H31O烷基尾有協(xié)同作用[8]，同時(shí)能讓活性RGD環(huán)表位暴露出來(lái)；(3)D2(DD)具有調(diào)節(jié)帶電離子作用，當(dāng)RGD環(huán)肽在自組裝成凝膠時(shí)，凝膠的pH范圍在7.35～7.45之間，正好適合細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化[8]；(4)RGD序列能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)凝膠的黏附、生長(zhǎng)及分化[1]。

本研究通過(guò)用高效液相色譜儀和質(zhì)譜儀進(jìn)行純化和分析，結(jié)果證明所合成的RGD環(huán)肽為所需的目的肽。用0.1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCl溶液及無(wú)菌雙蒸水將多肽調(diào)整濃度為10 mg/mL，此時(shí)的多肽溶液呈黏稠狀態(tài)，加入等體積含Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子無(wú)酚紅的DMEM/F12，數(shù)秒鐘后多肽成凝膠狀態(tài)，小管瓶口倒置，凝膠緊貼瓶底，有較強(qiáng)的黏附力，經(jīng)電子顯微鏡觀察凝膠發(fā)現(xiàn)凝膠由直徑2～5 nm，長(zhǎng)度100～1 000 nm的納米纖維構(gòu)成，納米纖維相互交織成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此類似凝膠含水量95.0%，對(duì)細(xì)胞有良好的骨架支持作用；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及細(xì)胞所需要的活性因子可通過(guò)凝膠間隙到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)排泄物可通過(guò)間隙排出凝膠外。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓細(xì)胞差異貼壁法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[9]，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，培養(yǎng)2周后的細(xì)胞呈漩渦式、魚(yú)狀排列，細(xì)胞表面CD29、CD90高表達(dá)，而CD34、CD45不表達(dá)，驗(yàn)證所取的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

BMSCs有許多優(yōu)點(diǎn)，包括來(lái)源豐富、高活性、低免疫原性、分化潛能和分泌養(yǎng)分，在移植研究中已得到廣泛的應(yīng)用[10]。BMSCs可以分泌多種趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子和生長(zhǎng)因子，這些因子可以進(jìn)一步聚集其他細(xì)胞(包括炎性細(xì)胞)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與組織修復(fù)，影響病理進(jìn)展[11]。因此，BMSCs為組織工程修復(fù)神經(jīng)損傷較理想的種子細(xì)胞。

RGD環(huán)兩性親肽納米凝膠與BMSCs混合形成三維細(xì)胞培養(yǎng)體系，凝膠的三維結(jié)構(gòu)具有良好的骨架結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支持作用；同時(shí)RGD環(huán)活性表位促進(jìn)細(xì)胞對(duì)凝膠的黏附、生長(zhǎng)及分化。本研究CCK-8結(jié)果顯示，在三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中BMSCs增殖速度比在二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中快。由鈣黃綠素乙酰氧基甲酯和PI構(gòu)成的DEAD/LIVE試劑可通過(guò)熒光顯微鏡顯色，觀察細(xì)胞在二維及三維細(xì)胞培養(yǎng)體系的活力和增殖情況，活細(xì)胞染成綠色，死細(xì)胞染成紅色[12]。本研究結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中的活細(xì)胞數(shù)較二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中多。

綜上所述，RGD環(huán)肽與BMSCs具有很好的細(xì)胞相容性，可為以后在仿生材料涉及的神經(jīng)組織工程中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造奠定基礎(chǔ)。

[1]Breymann C，Schmidt D，Hoerstrup SP．Umbilical cord cells as a source of cardiovascular tissue engineering[J]．Stem Cell Rev，2006，2(2)：87-92．

[2]元亮亮，梁鵬．自組裝多肽納米纖維支架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[J]．中國(guó)組織工程研究，2013，17(29)：5379-5386．

[3]陳睿，宋玉林，汪文玉，等．大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與樹(shù)枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性[J]．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2016，37(6)：803-809．

[4]Yip PK，Malaspina A．Spinal cord trauma and the molecular point of no return[J]．Mol Neurodegener，2012，7：6．

[5]Ruan L，Zhang H，Luo H，et al.Designed amphiphilic peptide forms stable nanoweb,slowly releases encapsulated hydrophobic drug,and accelerates animal hemostasis[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(13)：5105-5110．

[6]Sargeant TD，Guler MO，Oppenheimer SM，et al．Hybrid bone implants:self-assembly of peptide amphiphilic nanofibers within porous titanium[J]．Biomaterials，2008，29(2)：161-171．

[7]Hartgerink JD，Beniash E，Stupp SI．Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers[J]．Science，2001，294(5547)：1684-1688．

[8]宋玉林，鄭啟新，鄭劍鋒，等．兩親性肽自組裝凝膠與神經(jīng)干細(xì)胞相容性研究[J]．組織工程與重建外科雜志，2008，4(4)：192-195．

[9]李雙月，戚媛，陳若琳，等.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及優(yōu)勢(shì)[J]．中國(guó)組織工程研究，2014，18(10)：1484-1489.

[10]Hu J，Deng G，Tian Y，et al．An in vitro investigation into the role of bone marrowderived mesenchymal stem cells in the control of disc degeneration[J]．Mol Med Rep，2015，12(4)：5701-5708．

[11]Han X，Yang Q，Lin L，et al．Interleukin-17 enhances immunosuppression by mesenchymal stem cells[J]．Cell Death Differ，2014，21(11)：1758-1768．

[12]桑江瑋,王素雅，張杰，等．豬小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)肝細(xì)胞活力和功能基因表達(dá)的研究[J]．中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2017，31(5)：607-613.

Studyoncompatibilityofself-assembledgelcontainingRGDamphipathicpeptidewithbonemarrowmesenchymalstemcells*

XiaoRenshun，RuanHong，JiangXinghai，WuKai，WangXiaomei，SongYulin△

(DepartmentofOrthopedics,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

ObjectiveTo analyze the compatibility of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with amphiphilic peptide three-dimensional gel.MethodsThree healthy 3-week-old SD rats were taken for separating femur and tibia to obtain BMSCs,the BMSCs surface antigen was detected by flow cytometry；the 10 mg/mL RGD-cyclic amphiphilic peptide solution was added into the same volume of DMEM/F12 culture medium,after a few seconds,which was self assemble into three-dimensional gel.Three dimensional gel structure was observed by transmission electron microscope (TEM).1×106cells/mL BMSCs suspension and RGD-cyclic amphiphilic peptide were mixed to form a 3D culture system,1×106cells/mL BMSCs suspension was mixed with polylysine to form a 2D culture system,the serum-free culture was conducted;the CCK-8 method was used to observe the cell growth situation,calcein acetoxy methyl ester/propidium iodide (PI) double standard staining was performed.The effect of RGD-cyclic amphiphilic peptide on the proliferation of BMSCs was observed by fluorescence microscopy.ResultsThe separated and cultured BMSCs highly expressed CD29 and CD90,but lowly expressed or did not express CD34 and CD45;TEM showed that the gel was composed of multiple empty nanofibers with the nanofiber diameter of 2-5 nm and length of 100-1 000 nm;the molecular weight of synthetic peptides detected by mass spectrometry (MS) was 1 256.37,which was consistent with the theoretical value;the HPLC analysis showed that RGD-amphiphilic peptide purity was 95.88%;the calcein acetoxyl methyl ester/PI double staining showed that in the 3D culture system,a few BMSCs died after 30 min and the cells began to proliferate after 12 h,the proliferation was more active than that of 2D culture,and the difference was statistically significant (P<0.05);CCK-8 cell count showed that the proliferation activity of 3D culture system was higher than that of 2D culture system,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionRGD amphiphilic peptide has a good biocompatibility with BMSCs,and may become the tissue engineering scaffold material.

Arg-Gly-Asp；mesenchymal stem cells；amphiphilic peptide；cytocompatibility

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360271，30801158)；江西省教育廳課題(GJJ14054)；江西省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(20151BAB205051)；南昌大學(xué)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)基金(CX2016326)。

肖仁順(1991-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事脊髓損傷、兩性肽組織模塊方面的研究?！?/p>

，E-mail：songyulin2001@163.com。

R318

A

1671-8348(2017)35-4912-05

2017-07-12

2017-09-15)