孫響波， 于妮娜， 潘月麗

實(shí)驗(yàn)論著

腎綜顆粒對(duì)腎病綜合征大鼠微炎癥的影響

孫響波， 于妮娜， 潘月麗

目的探討腎綜顆粒對(duì)腎病綜合征大鼠微炎癥的影響。方法將40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)選取8只大鼠作為正常組，其余32只大鼠制備腎病綜合征模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組、激素組、腎綜顆粒組、激素加腎綜顆粒組，每組8只。除正常組、模型組外，其余各組分別予激素、腎綜顆粒、激素加腎綜顆粒干預(yù)，檢測(cè)血清核因子κB(NF-κB)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。結(jié)果激素加腎綜顆粒組能顯著降低腎病綜合征大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論激素加腎綜顆粒組對(duì)腎病綜合征大鼠微炎癥狀態(tài)具改善作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低IL-1β、TNF-α水平，減少IL-6的分泌，使C反應(yīng)蛋白、NF-κB含量降低等減慢炎癥因子的致炎效應(yīng)，阻斷炎癥進(jìn)程。

腎病綜合征； 腎綜顆粒； 微炎癥； 大鼠

微炎癥即炎性蛋白、炎性因子升高的非顯性免疫炎癥狀態(tài)[1-2]。炎癥細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)可能參與原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)的發(fā)病[3]。諸多研究發(fā)現(xiàn)PNS患者普遍存在著微炎癥反應(yīng)，微炎癥發(fā)病機(jī)制尚未明確，但細(xì)胞因子分泌紊亂與微炎癥狀態(tài)的發(fā)生密切相關(guān)，微炎癥對(duì)PNS的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后都具有重要臨床意義[4-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎綜顆粒對(duì)臨床PNS患者治療有效，本研究通過(guò)復(fù)制阿霉素腎病綜合征大鼠模型，進(jìn)一步探討腎綜顆粒對(duì)大鼠模型血清核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平影響，闡釋其改善微炎癥狀態(tài)的干預(yù)機(jī)制，從改善微炎癥角度為臨床治療PNS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量220 g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(魯)2009-0001]。潑尼松片(5 mg/片)，腎綜顆粒(由黃連、黃芩、黃柏、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、梔子、生地黃、赤芍、柴胡、三七粉、甘草組成，本院藥劑科制作)，阿霉素針(10 mg/支)，EL340i型全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]；GL20A型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠)；SSW型電熱恒溫水浴箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；IL-1β測(cè)試盒(批號(hào)：E-30418)、IL-6測(cè)試盒(批號(hào)：E-30644)、TNF-ɑ測(cè)試盒(批號(hào)：E-30633)、NF-κB測(cè)試盒(批號(hào)：E-30512)、C反應(yīng)蛋白測(cè)試盒(批號(hào)：E-30458)，試劑盒全部由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。

1.2 模型制備 將40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法選取8只大鼠作為正常組，其余32只大鼠參照文獻(xiàn)[4]方法制備模型，32只大鼠進(jìn)行鹽酸阿霉素6.5 mg/kg尾靜脈注射，正常組進(jìn)行生理鹽水尾靜脈注射，注射后將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中，自由攝食飲水，1周后開始記錄尿蛋白定性情況，當(dāng)尿蛋白定性≥+++時(shí)，24 h尿蛋白定量≥100 mg/kg，并持續(xù)3 d以上者，即為造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、激素組、腎綜顆粒組、激素加腎綜顆粒組，每組8只，正常組與模型組給予等量生理鹽水灌胃，腎綜顆粒組予腎綜顆粒9 g/kg灌胃；激素組給予潑尼松5.4 mg/kg灌胃，激素加腎綜顆粒組，以腎綜顆粒9 g/kg、潑尼松5.4 mg/kg灌胃。于造模成功后每日1次，共12周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組、激素組大鼠各死亡2例，腎綜顆粒組、激素加腎綜顆粒組各死亡1例，死亡大鼠消瘦嚴(yán)重。

1.4 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)從第12周的20：00禁食不禁水12 h，次日全部大鼠稱重，用水合氯醛腹腔注射麻醉10 mL/kg，打開腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置1 h，促凝管血樣迅速低溫離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃，離心半徑77 mm)，分離血清，分別用于IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、C反應(yīng)蛋白含量檢測(cè)，其測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

各組大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、C反應(yīng)蛋白含量比較見表1。

表1 各組大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP含量比較

注：與模型組比較，aP<0.05；與激素組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，與激素組和腎綜顆粒組比較，激素加腎綜顆粒組能明顯降低腎綜大鼠模型血清IL-6、CRP、NF-κB、IL-1β、TNF-α含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

PNS目前主要以西醫(yī)治療為主要方法，但其病程長(zhǎng)，激素毒副作用大，且復(fù)發(fā)率高，治療頗為棘手，中西醫(yī)結(jié)合方法在臨床得到廣泛應(yīng)用，取得較好效果，目前中醫(yī)藥治療PNS在減少PNS復(fù)發(fā)，消除蛋白尿，減輕激素、細(xì)胞毒性藥物毒副作用中取得了很好的療效[6]。中醫(yī)學(xué)中無(wú)腎病綜合征相關(guān)文獻(xiàn)，究其發(fā)病特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及其預(yù)后轉(zhuǎn)歸等，符合中醫(yī)學(xué)“水腫病”的討論診治范疇。本病屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以脾、肺、腎三臟之虛為本，以風(fēng)邪、水濕、瘡毒、瘀血為四標(biāo)。氣血痰與虛濕瘀病機(jī)為PNS的基本病機(jī)[7-9]。濕熱為蛋白尿主因，“濕”作為主要病機(jī)貫穿整個(gè)疾病發(fā)展全過(guò)程[10]，臨證以擅用清熱解毒利濕，活血化瘀，益氣養(yǎng)陰，健脾補(bǔ)腎等法施治PNS[11]。腎綜顆粒是在黃連解毒湯與桃紅四物湯基礎(chǔ)上加柴胡、甘草、三七而成。黃連、黃芩、黃柏、梔子為君藥，黃連解毒湯具苦寒直折，瀉火解毒功效，多用于實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。臣以桃仁、紅花、生地、赤芍、當(dāng)歸、川芎，桃紅四物湯以活血，輔以行氣、養(yǎng)血，配伍后使瘀血得化、新血得生、氣機(jī)調(diào)暢。佐以柴胡引藥入肝，升達(dá)清陽(yáng)，調(diào)暢氣機(jī)，三七善祛瘀生新，活血定痛，且補(bǔ)血止血。甘草補(bǔ)脾和中，助歸芍成氣虛之功，助黃芩、黃連、黃柏清熱解毒，合芍藥緩急止痛，又可調(diào)和諸藥。前期臨床研究證實(shí)，激素加腎綜顆粒治療PNS能明顯下調(diào)PNS患兒血脂和超敏C反應(yīng)蛋白水平，對(duì)PNS患兒“微炎癥”狀態(tài)有明顯改善作用[12]。PNS患兒免疫功能紊亂導(dǎo)致對(duì)促炎性細(xì)胞因子的清除能力減弱，使得循環(huán)血液中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、CRP等急性時(shí)相蛋白水平增高。PNS患者血清中的炎癥指標(biāo)CRP、IL-6水平均較健康人顯著增高，提示PNS患者體內(nèi)確實(shí)存在著微炎癥狀態(tài)[13]。有研究證實(shí)IL-1β和TNF-α可誘導(dǎo)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB活化[14-15]。小兒PNS發(fā)病時(shí)IL-1β、IL-6、NF-κB等炎癥介質(zhì)而加重腎臟損害，IL-1β參與PNS的發(fā)病，可加重病情的進(jìn)展，終致使腎小球硬化、纖維化。IL-1β是參與PNS的重要炎癥因子，IL-6促進(jìn)B細(xì)胞增殖，可誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如IL-1、IL-2和TNF-ɑ等產(chǎn)生及釋放，并且可增強(qiáng)IL-1和TNF-ɑ等炎癥的破壞作用；CRP可誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子和組織因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，是微炎癥狀態(tài)的一項(xiàng)客觀、敏感的指標(biāo)，NF-κB是參與了多種炎癥反應(yīng)的一種細(xì)胞因子，可介導(dǎo)多種炎性因子的活化、促進(jìn)纖維化因子的合成，致使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)微炎癥的發(fā)生。前期研究發(fā)現(xiàn)，腎綜顆粒能顯著緩解毒瘀互結(jié)型PNS的癥狀，降低尿蛋白，改善高凝狀態(tài)，且能有效制約激素副作用[16]。與正常組比較，模型組、激素組、腎綜顆粒組、激素加腎綜顆粒組大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP含量明顯升高，提示PNS大鼠血清細(xì)胞因子分泌紊亂，處于微炎癥狀態(tài)。與模型組比較，激素組、腎綜顆粒組、激素加腎綜顆粒組均可降低PNS大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平；與激素組比較，激素組加腎綜顆粒組能顯著降低PNS大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平，可見，激素加腎綜顆粒組療效優(yōu)于單用激素組和腎綜顆粒組。因此我們推測(cè)腎綜顆粒對(duì)PNS大鼠微炎癥具有效改善作用，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平相關(guān)，抑制炎性因子IL-1β、TNF-ɑ、IL-6、CRP等產(chǎn)生與釋放，通過(guò)下調(diào)IL-1β、TNF-ɑ，減少IL-6分泌，降低CRP、NF-κB含量，減慢炎性因子的致炎效應(yīng)，阻斷炎癥通路。

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EffectofShenzonggranuleonmicro-inflammationintheratswithprimarynephroticsyndrome

SUNXiangbo，YUNina，PANYueli.

QingdaoHaiciMedicalGroup，Qingdao266000，China

ObjectiveTo study the effect of Shenzong granule on micro-inflammation in the rats with nephritic syndrome.MethodsOf 40 SPF male Wistar rats,8 were chosen randomly as the normal control group (group A),and the remained 32 rats were made into nephrotic syndrome models,which were then divided into 4 groups with 8 in each group:model group(B),hormone group(C),Shenzong group(D) and hormone plus Shenzong group(E).Group C，D and E were intervened respectively with hormone,Shenzong granule and hormone plus shenzong granule;detect the level of serum neuclear factor κB(NF-κB),interleukin 1β(IL-1β),tumor necrosis factor α(TNF-α),IL-6,and C-reactive protein(CRP).ResultsThe level of NF-κB,IL-1β,TNF-α,IL-6 and CRP in rats with nephrotic syndrome was significantly reduced in group E,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionThe micro-inflammation in rats with nephrotic syndrome is improved by hormone and Shenzong granule. Its working mechanism may be through reducing IL-1β and TNF-α level,the IL-6 secretion,and decreasing the content of CRP and NF-κB,which results in slowing down the reaction of inflammation factors and blocking the inflammation.

Nephrotic syndrome; Shenzong granule; Micro-inflammation; Rat

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012ZRB14098)

266000 山東 青島，青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)(青島市中醫(yī)醫(yī)院)腎病科

孫響波(1982-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥治療腎病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究

孫響波，E-mail：sunxiangbo1982@163.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.06.003

R-332

A

1674-3865(2017)06-0472-03

2016-11-08)

吳迪)