劉光華， 劉娟， 高暢， 張聰聰， 賈曉妍

實(shí)驗(yàn)論著

甘露消毒丹及其揮發(fā)油對流感病毒感染小鼠RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路的影響

劉光華， 劉娟， 高暢， 張聰聰， 賈曉妍

目的觀察甘露消毒丹及其揮發(fā)油對流感病毒感染小鼠血清中白細(xì)胞介素4(IL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素α/β(IFN-α/β)含量及肺組織中非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ) mRNA、核因子κB(NF-κB)蛋白的影響，以探討甘露消毒丹及其揮發(fā)油抗病毒作用的分子機(jī)制。方法選擇SPF級BALB/c小鼠36只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組，每組6只。除正常組外，其余5組以流感病毒FM1-6-E2滴鼻造模。于造模后第7天，摘眼球放血處死小鼠，通過透射電子顯微鏡對肺組織進(jìn)行檢測以及圖像分析，采用ELISA法測定血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量，qRT-PCR檢測各組小鼠肺組織中NS1、RIG-Ⅰ mRNA的表達(dá)，Western blot方法測定各組小鼠肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果(1)流感病毒感染后模型小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)可見Ⅱ型細(xì)胞壞死、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)纖毛增粗、脫落，形成肺部炎癥；各治療組均可改善肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常改變。(2)流感病毒感染小鼠后，血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β的含量及肺組織中的NS1、RIG-Ⅰ mRNA、NF-κB蛋白表達(dá)均高于正常組，模型組與正常組比較，差異顯著；與模型組比較，灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組血清中IFN-α/β含量顯著升高，IL-4、TNF-α含量及NS1 mRNA、RIG-ⅠmRNA、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，甘露消毒丹各治療組不同劑型抗流感病毒作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，灌胃滴鼻合用組>灌胃組>滴鼻組。結(jié)論甘露消毒丹具有抗流感病毒感染的作用，通過抑制RIG-Ⅰ/NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化，阻止炎癥的病理反應(yīng)，提高免疫因子含量，降低流感病毒引起的免疫炎性損傷。

流感病毒感染； 甘露消毒丹； 揮發(fā)油； RIG-Ⅰ； NF-κB； 小鼠

流感病毒感染是一類具有高發(fā)病率和高死亡率的傳染性病毒，其所致感染性疾病可引起全球范圍內(nèi)流行[1]。中醫(yī)藥在防治流感中所發(fā)揮的作用日趨受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界專家的高度重視[2-4]。甘露消毒丹乃“濕溫時(shí)疫之主方”，應(yīng)用于臨床各科感染性病變均有顯著療效，尤適于急性外感熱病濕熱證的治療[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘露消毒丹除能抑制殺滅病毒，阻止病毒復(fù)制，還能夠加強(qiáng)抗病毒能力，并能誘生干擾素和加強(qiáng)干擾素誘導(dǎo)以提高機(jī)體免疫力[6]。機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)在抗病毒感染方面發(fā)揮著重要的作用，模式識別受體中的RIG-Ⅰ樣受體是細(xì)胞質(zhì)中一類RNA解旋酶，能夠識別病毒復(fù)制產(chǎn)生的RNA，對抗病毒天然免疫的建立起著非常重要的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)擬采用流感病毒感染小鼠，應(yīng)用不同技術(shù)檢測小鼠血清中白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素α/β(interferon-α/β，IFN-α/β)含量及肺組織非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，NS1)、維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ) mRNA、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)蛋白的變化，探討甘露消毒丹及其揮發(fā)油抗流感病毒作用，及其與RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47(H1N1)，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供，凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級BALB/c小鼠36只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購買于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2013-0009，使用許可證號：SYXK(遼)2015-0001。

1.1.3 藥物 甘露消毒丹藥物組成：滑石、黃芩、茵陳、石菖蒲、川貝母、木通、藿香、連翹、白蔻仁、薄荷、射干，中藥飲片均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥局，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室鑒定為正品。飲片以8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，合并每組3次提取的藥液，回收溶劑并濃縮，制成含生藥1 g/mL混懸液。揮發(fā)油制備：將中藥粉碎，加8倍量水浸泡，裝入冷凝器中，水蒸氣蒸餾提取6 h，分層分取揮發(fā)油，制成含生藥6 g/mL的藥液。陽性對照藥物：磷酸奧司他韋顆粒(宜昌長江藥業(yè)有限公司，批號：0371609002)75 mg，配成1 g/L的溶液。每組藥液分別4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試劑 小鼠IL-4、TNF-α ELISA試劑盒、Phospho-NF-κBp65(S529)一抗(BM3994)、ECM Ⅱ of Western Blotting檢測試劑盒濃縮型兔IgG二抗、GAPDH(武漢博士德生物工程有限公司)，IFN-α/β ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)，Trizol總RNA提取試劑(Invitrogen公司)，qRT-PCR試劑盒、DEPC、DNA marker DL2000(大連寶生物工程有限公司)。根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]合成引物NS1、RIG-Ⅰ，NS1上游5′-ATG GAT CCA AAC ACT GTG TC-3′，下游5′-TCA AAC TTC TGA CCT AAT TGT TCC-3′，RIG-Ⅰ上游5′-GCA GGT TAC TGT GGA CTT TGT G-3′，下游5′-TGC CAT TCT CCC TTT AGT GTC T-3′，購于北京六合華基因公司，25%戊二醛(天津福晨化學(xué)試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 將36只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常組、模型組、灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組，每組6只。灌胃組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組于感染后24 h開始灌胃給藥，每日1次，每次0.3 mL，滴鼻組、灌胃滴鼻合用組于感染后24 h開始滴鼻給藥，每日1次，每次0.04 mL。正常組、模型組同步灌胃給生理鹽水0.3 mL。最后一次給藥后禁水、禁食4 h。

1.2.2 模型制備 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后稱重，除正常組外，其余動物均制備流感病毒感染模型。在乙醚輕度麻醉下，經(jīng)鼻腔接種甲型流感病毒FM1株(0.1 mL/只)。正常組動物隔離飼養(yǎng)在同等條件下的房間，并按同樣方法鼻腔接種生理鹽水0.1 mL。

1.2.3 標(biāo)本采集及檢測方法 于造模后第7天采集標(biāo)本，每組取6只，稱動物體質(zhì)量后，摘除眼球取血后殺死并解剖小鼠，取血后儲存于促凝管中，后放入離心機(jī)中以4 000 r/min的速度離心5 min，離心后取上層血清存于EP管中，放入-80 ℃冰箱中冷藏以備ELISA檢測，取出小鼠的全肺以做qRT-PCR檢測樣本。取約1 mm×1 mm×1 mm左下肺組織在4 ℃下用2.5%戊二醛固定，用透射電鏡進(jìn)行觀察。血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量采用ELISA法測定，檢測程序按照試劑盒說明書進(jìn)行；肺組織中的NS1、RIG-Ⅰ mRNA的表達(dá)采用qRT-PCR法檢測，將取出的各組小鼠肺組織制造細(xì)胞懸液，用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA。分析RNA的純度及完整性，檢測RNA質(zhì)量合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)并合成NS1、RIG-Ⅰ的引物，進(jìn)行qRT-PCR檢測；肺組織中NF-κB的蛋白表達(dá)采用Western blot檢測，用總蛋白提取試劑提取總蛋白，離心取上清液，-20 ℃冰箱中保存。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，用蒸餾水調(diào)整到統(tǒng)一濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，蛋白上樣每孔含10 μL，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜30 min，2%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。一抗室溫孵育2 h，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光，F(xiàn)luor Chem Q蛋白質(zhì)印跡，成像系統(tǒng)顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下觀察小鼠肺超微結(jié)構(gòu) 正常組可見Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞游離面微絨毛豐富，細(xì)胞間連接較緊密(圖1a,見封三)。模型組病變可見核不規(guī)則，核染色質(zhì)凝集粗塊，間質(zhì)膠原纖維大量堆積，排列縱橫交錯，細(xì)胞壞死(圖1b,見封三)，肺泡腔內(nèi)纖毛增粗、脫落(圖1c,見封三)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞(圖1d,見封三)。各藥物治療組Ⅱ型肺泡細(xì)胞數(shù)目增多，板層小體形態(tài)規(guī)整、數(shù)量較少，絨毛較豐富，肺泡隔增厚不明顯，間質(zhì)內(nèi)見少量的膠原纖維。

2.2 小鼠血清中各細(xì)胞因子的變化 見表1。

表1 甘露消毒丹及其揮發(fā)油對血清中IFN-α/β和IL-4、TNF-α含量的影響

注：與模型組比較，aP<0.05；灌胃滴鼻合用組，bP<0.05；與奧司他韋組比較，cP<0.05。

表1結(jié)果表明，流感病毒感染后小鼠血清中IFN-α/β含量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組和奧司他韋組血清中IFN-α/β含量顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、奧司他韋組血清中IFN-α/β含量顯著低于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組血清中IFN-α/β含量顯著高于奧司他韋組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滴鼻組血清中IFN-α/β含量與奧司他韋組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組升高血清IFN-α/β含量總體療效可見：灌胃滴鼻合用組>灌胃組>滴鼻組>奧司他韋組。

流感病毒感染小鼠后，模型組血清中IL-4水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組血清中IL-4水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滴鼻組血清中IL-4水平顯著低于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；灌胃組、奧司他韋組血清中IL-4水平與灌胃滴鼻合用組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌胃組、滴鼻組血清中IL-4水平與奧司他韋組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組降低血清IL-4療效總體可見：灌胃滴鼻合用組>灌胃組>奧司他韋組>滴鼻組。

流感病毒感染小鼠后，模型組血清中TNF-α水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組血清中TNF-α水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、奧司他韋組血清中TNF-α水平顯著高于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滴鼻組血清中TNF-α水平顯著高于奧司他韋組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；灌胃組血清中TNF-α水平與奧司他韋組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組降低血清TNF-α療效總體可見：灌胃滴鼻合用組>奧司他韋組>灌胃組>滴鼻組。

2.3 qRT-PCR檢測NS1、RIG-Ⅰ mRNA的水平 見表2。

表2 甘露消毒丹及其揮發(fā)油對小鼠肺組織內(nèi)NS1、RIG-Ⅰ mRNA水平的影響

注：與模型組比較，aP<0.05；與灌胃滴鼻合用組比較，bP<0.05。

表2結(jié)果表明，各治療組小鼠肺組織內(nèi)RIG-Ⅰ mRNA水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、奧司他韋組肺組織內(nèi)RIG-Ⅰ mRNA表達(dá)顯著高于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組肺組織內(nèi)RIG-Ⅰ mRNA表達(dá)與奧司他韋組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組間降低肺組織RIG-Ⅰ mRNA表達(dá)總體療效可見：灌胃滴鼻合用組>灌胃組>滴鼻組>奧司他韋組。

小鼠感染流感病毒后，灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組肺組織中NS1 mRNA表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、奧司他韋組肺組織中NS1 mRNA表達(dá)顯著高于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；滴鼻組肺組織中NS1 mRNA表達(dá)與灌胃滴鼻合用組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌胃組、滴鼻組肺組織內(nèi)NS1 mRNA表達(dá)與奧司他韋組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組間降低肺組織NS1 mRNA表達(dá)總體療效可見：灌胃滴鼻合用組>滴鼻組>奧司他韋組>灌胃組。

2.4 Western blot檢測磷酸化NF-κB蛋白水平 見表3和圖2。

表3 甘露消毒丹及其揮發(fā)油對小鼠肺組織內(nèi)NF-κB蛋白水平的影響

注：與模型組比較，aP<0.05；與灌胃滴鼻合用組比較，bP<0.05；與奧司他韋組比較，cP<0.05。

表3結(jié)果表明，小鼠造模后肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、灌胃滴鼻合用組、奧司他韋組肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組、奧司他韋組肺組織內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)顯著高于灌胃滴鼻合用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃組、滴鼻組肺組織內(nèi)NF-κB蛋白高于奧司他韋組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組療效總體可見：灌胃滴鼻合用組>奧司他韋組>灌胃組>滴鼻組。

圖2 流感病毒感染小鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)

3 討論

流感病毒屬于正黏病毒，為單股負(fù)鏈RNA病毒，在病毒復(fù)制過程中，NS1作為流感病毒唯一具有多種活性的調(diào)控因子的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與其復(fù)制和傳播。在感染的早期，大量存在于細(xì)胞核中，而在感染的晚期，NS1蛋白也可出現(xiàn)于細(xì)胞漿中，且能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NS1蛋白的抗體[10]。NS1蛋白能通過與RNA結(jié)合，抑制IFN-a/β的產(chǎn)生和釋放[11]，與流感病毒所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間存在一定的聯(lián)系[12]。近年研究發(fā)現(xiàn)天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體在急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。RIG-Ⅰ樣受體能夠識別細(xì)胞質(zhì)中的病毒RNA，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致Ⅰ型IFN的活化[13]和NF-κB的入核[14]。在RIG-Ⅰ樣受體識別病毒RNA后，引起MAVS的活化，進(jìn)而將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游，活化IRF3/7[15]，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。而活化的MAVS還可將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給IKK復(fù)合物(包含IKKα、IKKβ、IKKγ)，最后導(dǎo)致NF-κB和IκB α復(fù)合物的磷酸化，磷酸化的IκB α從NF-κB上脫落并降解，活化的NF-κB入核，促進(jìn)促炎因子和炎性趨化因子的產(chǎn)生[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流感病毒感染組小鼠肺組織內(nèi)NS1、RIG-Ⅰ mRNA水平顯著升高(P<0.05)，NF-κB蛋白的表達(dá)增高(P<0.05)，血清中的IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量亦明顯升高(P<0.05)，RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路被激活。流感病毒主要侵入機(jī)體呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，并繁殖、復(fù)制，引起細(xì)胞產(chǎn)生空泡、變性并迅速產(chǎn)生子代病毒體擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞，再周而復(fù)始，重復(fù)病毒增殖周期。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡發(fā)現(xiàn)流感病毒感染小鼠的肺組織超微結(jié)構(gòu)可見肺泡腔內(nèi)纖毛增粗、脫落，Ⅱ型細(xì)胞壞死、肺泡結(jié)構(gòu)破壞。本實(shí)驗(yàn)通過甘露消毒丹水蒸氣蒸餾提取淡黃色揮發(fā)油滴鼻與甘露消毒丹醇提物灌胃作用于流感病毒感染的小鼠，發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹灌胃滴鼻合用能夠顯著的控制肺部炎癥，抑制RIG-Ⅰ mRNA、NF-κB蛋白的過度表達(dá)，同時(shí)能提高IFN-α/β含量，降低IL-4、TNF-α的含量，較單一揮發(fā)油組效果顯著；在抑制NS1 mRNA升高方面，甘露消毒丹滴鼻組的效果較灌胃組更加顯著，提示鼻黏膜給藥抑制呼吸道病原體感染具有一定優(yōu)勢。

流感病毒歸屬中醫(yī)學(xué)“瘟疫”“溫病”等范疇，為感受非時(shí)之氣或疫癘之邪，外淫肌腠，內(nèi)蘊(yùn)肺胃而為病。其發(fā)病與機(jī)體免疫功能的失調(diào)和降低密切相關(guān)。甘露消毒丹為治濕熱時(shí)疫經(jīng)典方，針對“熱、毒、濕、濁”組方，由滑石、黃芩、茵陳等11味中藥組成。該方苦辛芳香，能清熱利濕、化濁解毒，非苦寒不能清其熱，非淡滲不能利其濕，故必然分治之。其中黃芩、連翹，苦寒清熱，熱清則濕邪易祛；重用茵陳、滑石，濕邪得去，則熱勢必孤。又因濕熱郁蒸，易于成毒成濁，故于清熱滲利之中，配以芳香辟穢之藿香、白豆蔻、薄荷，故毒可解，濁可化[17]。其方中連翹、黃芩均具有廣譜抗菌、抗流感病毒、解熱鎮(zhèn)痛的作用[18]；茵陳、石菖蒲、藿香、薄荷、白豆蔻等芳香類藥材富含揮發(fā)油，茵陳揮發(fā)油能夠抑制炎性遞質(zhì)表達(dá)[19]，薄荷油可以干擾病毒包膜結(jié)構(gòu)[20]。揮發(fā)油是一類由小分子物質(zhì)組成，具有芳香開竅、引藥上行作用，可被機(jī)體迅速吸收的油狀揮發(fā)性液體。甘露消毒丹揮發(fā)油具有明顯的抗炎、抗病毒作用，且滴鼻給藥方式簡便快捷，具有廣泛應(yīng)用空間。

本研究發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹具有抗流感病毒感染的作用，通過免疫調(diào)節(jié)降低流感病毒引起的免疫炎性損傷，抑制RIG-Ⅰ/NG-κB表達(dá)、增加IFN-α/β含量及降低IL-4、TNF-α的分泌，是其作用機(jī)制之一。甘露消毒丹醇提物及揮發(fā)油合用，即一方兩用，既能抑制NF-κB的活性，阻止炎癥的病理反應(yīng)，又能提高免疫因子含量，較單一給藥更有優(yōu)勢，其深入作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] 劉穎,鄧巍,徐艷峰,等.甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(12):1-4.

[2] 趙靜,王永炎,王燕平,等.中醫(yī)藥防治甲型H1N1流感系統(tǒng)研究與體系建設(shè)的實(shí)踐與思考[J].中醫(yī)雜志,2013,54(5):382-385.

[3] 胡楠楠,王雪峰,王子,等.銀翹散精簡方、玉屏風(fēng)散提取物在雞胚中抗甲型流感病毒FM1株阻斷與抑制作用研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2013,5(6):514-517.

[4] 劉雙,王雪峰,郝歐美.清肺通絡(luò)敷胸膏對流感病毒肺炎大鼠肺組織ERK/NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2017,9(2):93-96.

[5] 艾碧琛,賀又舜.甘露消毒丹抗病毒作用的臨床與實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(8):1664-1667.

[6] 鄭金粟,顧立剛.痰熱清注射液對流感病毒FM1感染小鼠抗病毒作用的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(7):851-854.

[7] Zeng W,Sun L,Jiang X，et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity[J]．Cell,2010,141(2):315-330.

[8] 劉永飛,李志輝,王慧煜,等.A型流感病毒NS1蛋白對細(xì)胞生長調(diào)控的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2012,42(12):1242-1248.

[9] 王曉玲,藺文成,劉芹防,等.豬RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7 mRNA TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(12):953-956.

[10]Krug RM,Yuan W,Noah DL，et al. Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells:the roles of the viral NS1 protein[J]. Virology，2003，309(2):181-189.

[11]于馨,張彩.炎癥小體信號通路的負(fù)調(diào)控[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2014,41(1):87-95.

[12]孫進(jìn)華,吳明福,邢明偉,等.A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及臨床應(yīng)用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2006,33(8):724-729.

[13]趙鋼德,謝青.RIG-Ⅰ在抗病毒感染中作用的研究進(jìn)展[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2007,34(1):46-48.

[14]Zhu H,Shi X,Ju D，et al. Anti-inflammatory effect of thalidomide on H1N1 influenza virus-induced pulmonary injury in mice[J]. Inflammation，2014，37(6):2091-2098.

[15]Chen H,Jiang Z. The essential adaptors of innate immune signaling[J]. Protein Cell，2013，4(1):27-39.

[16]Eisencher K,Krug A. Regulation of RLR-mediated innate immune signaling--it is all about keeping the balance[J]. Eur J Cell Biol，2012，91(1):36-47.

[17]程方平,李家庚,劉松林,等.甘露消毒丹對濕熱證大鼠模型的干預(yù)[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2008,36(6):36-38.

[18]曹軍連.甘露消毒丹加減治療手足口病41例臨床觀察[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2009,38(3):106-107.

[19]Cha JD,Moon SE,Kim HY，et al. The essential oil isolated from Artemisia capillaris prevents LPS-induced production of NO and PGE(2) by inhibiting MAPK-mediated pathways in RAW 264.7 macrophages[J]. Immunol Invest，2009，38(6):483-497.

[20]曹蓉,朱玲玲,龍玲,等.甘露消毒丹抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究概況[J].湖南中醫(yī)雜志,2014,30(10):191-193.

EffectsofGanluXiaodumicropillanditsvolatileoilonRIG-Ⅰ/NF-κBsignalingpathwayinmiceinfectedwithinfluenzavirus

LIUGuanghua，LIUJuan，GAOChang，ZHANGCongcong，JIAXiaoyan.

MedicalDepartmentofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China

ObjectiveTo observe the effects of Ganlun Xiaodu micropill(GXM) and its volatile oil on the levels of IL-4, TNF-α, IFN-α/β and NS1 mRNA, RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein in lung tissue of mice infected with influenza virus(IV)， in order to explore the molecular mechanism of the antiviral effect of GXM and its volatile oil.MethodsA total of 36 SPF BALB/c mice， half female and half male， were randomly divided into 6 groups， with 6 rats in each group. They were normal group(A group)， model group(B group)， gavage group(C group)， intranasal group(D group)， combination group(E group) and oseltamivir group(F group). Except the normal group， the remained 5 groups were modeled with influenza virus FM1-6-E2. On the seventh day after the model， the mice were killed by picking up the eyeball and releasing blood. The lung tissue was detected by transmission electron microscope and the image was analyzed. The content of IL-4, TNF-α and IFN-α/β in serum was determined by ELISA，and the expression of NS1 and RIG-ⅠmRNA in lung tissue of mice was detected by qRT-PCR. Western blot method was used to determine the expression of NF-κB protein in lung tissues of mice.Results(1) The ultrastructure of lung tissue in the model mice after IV infection showed necrosis of type Ⅱ cells， destruction of alveolar structure， thickening and shedding of cilium in the alveoli， and pulmonary inflammation was formed. All the treatment groups were improved in the ultrastructural abnormal change of the alveolar type Ⅱ epithelial cells.(2) After IV infection in mice， the content of IL-4, TNF-α and IFN-α/β in serum and the expression of NS1 mRNA, RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein in lung tissues were all higher than those in A group. The difference was significant between B group and A group; Compared with the B group， the serum levels of IFN-α/β in the serum of C，D，E and F groups increased significantly， while the content of IL-4， TNF-α and the expression of NS1 mRNA， RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein were obviously down-regulated (P<0.05). There was significant difference in the anti-IV effect among different dosage forms of GXM treatment groups(P<0.05)，the effect being E group>C group>D group.ConclusionGXM has the function of anti-IV infection. It inhibits the pathological reaction of inflammation， enhances the content of immune factors and reduces the immune inflammatory injury induced by IV by inhibiting the activation of RIG-Ⅰ/NF-κB signaling pathway.

Influenza virus infection; Ganlu Xiaodu micropill; Volatile oil; RIG-Ⅰ; NF-κB； Mice

國家自然基金青年項(xiàng)目(81403293)

110847 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院溫病學(xué)教研室(劉光華)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)專業(yè)研究生(劉娟，高暢，張聰聰，賈曉妍)

劉光華(1974-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治感染性疾病

劉光華，E-mail:liugh76@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.06.001

R-332

A

1674-3865(2017)06-0461-06

2017-10-23)

劉穎)