任彥榮，張忠明，謝躍杰，熊政委，王仲明，吳洪斌*

微波輔助水酶法優(yōu)化紅棗中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）提取工藝及其抗疲勞作用

任彥榮1,2，張忠明3，謝躍杰1，熊政委1,2，王仲明1，吳洪斌4,*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067；2.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 737100；4.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

以新疆紅棗為原料提取環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate，cAMP），通過響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助復(fù)配酶法提取cAMP工藝，并建立回歸模型；同時研究cAMP提取物對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠的游泳耐力的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝為復(fù)配酶（纖維素酶-半纖維素酶-果膠酶）質(zhì)量比1∶1∶1、復(fù)配酶添加量1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、酶解溫度31.3 ℃、酶解時間20 min、微波功率500 W，在此條件下cAMP提取量為560.9 μg/g；新疆紅棗cAMP提取物能延長小鼠力竭游泳時間，增加小鼠游泳耐力，說明cAMP對小鼠具有很好的抗疲勞作用。新疆紅棗作為cAMP的提取原料在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

紅棗；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）；微波輔助水酶法提取；游泳耐力

紅棗（Z i z y p h u s j u j u b e M i l 1.）系鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus Mil1.）植物的果實，在我國與桃、李、杏、栗并稱“中國五果”。紅棗不僅口味鮮美，同時也具有極強(qiáng)的藥用價值[1-2]。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，紅棗獨特的調(diào)節(jié)機(jī)體功能與其含有的多糖、黃酮、維生素、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate，cAMP）等活性物質(zhì)緊密相關(guān)[3-5]。cAMP為核苷酸的衍生物，是有機(jī)體中廣泛存在的重要活性物質(zhì)[6-8]。在血管擴(kuò)張、心肌缺氧、舒張平滑肌、神經(jīng)再生、血糖調(diào)節(jié)、肝功能等方面具有良好的改善作用，同時可促進(jìn)細(xì)胞調(diào)節(jié)功能和呼吸鏈氧化酶的活性[9-10]。

近年來新疆紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其品質(zhì)享譽(yù)全國，但同時新疆紅棗產(chǎn)業(yè)存在著加工水平低、品種單一、市場競爭力低等問題；為了解決紅棗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中的上述問題，針對目前新疆紅棗加工能力較弱及資源綜合利用較低的情況，研究學(xué)者對紅棗提取技術(shù)進(jìn)行了廣泛的探討。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，紅棗中存在豐富的cAMP，是一種優(yōu)質(zhì)的cAMP提取資源，不同種類的紅棗鮮果的cAMP含量約1.23～99.60 μg/g，平均含量為12.53 μg/g，在水果中含量最高，約為酸棗的2 倍，是梨、桃的近千倍[11-13]。目前，cAMP的主要提取方法為水提法、乙醇提取法、酶法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、微波-超聲波輔助提取等[14-17]；王立霞[14]研究了微波輔助提取和田玉棗cAMP工藝參數(shù)，并與傳統(tǒng)溶劑法和超聲波輔助法對比，結(jié)果表明，微波輔助法較傳統(tǒng)溶劑法和超聲波輔助法提取量高、提取時間短、能耗低。微波輔助水酶法提取技術(shù)利用微波熱效應(yīng)和分子振動降低反應(yīng)活化能的非熱效應(yīng)，可以縮短酶解時間，從而提高提取效率、降低成本，已被廣泛應(yīng)用于天然有效成分的提取[18-22]。目前采用微波輔助水酶法提取紅棗中cAMP的方法鮮有報道。本實驗以新疆紅棗為研究對象，采用單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助復(fù)配酶法提取cAMP工藝，同時研究了cAMP提取物對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠的游泳耐力的影響，可對紅棗深加工和專屬功效紅棗產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆紅棗2015年10月份采摘（充分成熟，新鮮）；SPF級昆明種小鼠50 只，體質(zhì)量18～22 g。

D-半乳糖 美國Sigma Aldrich公司；對照品cAMP（50 mg/瓶） 中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀、檸檬酸（分析純）、甲醇（色譜純） 成都科龍試劑廠；本實驗所用水均為雙蒸水，實驗所有溶液均為自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

12 00液相色譜-6 46 0三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司；MAS-II常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海滬西儀器設(shè)備公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理方法

紅棗樣品去核后置于冷凍干燥機(jī)（-50 ℃，1 0 0 P a）中干燥。各樣品均干燥至含水率約為（8±1）%。干燥后樣品進(jìn)行粉碎并過60 目篩，真空密封后置于常溫干燥器中備用。

1.3.2 微波輔助酶法提取cAMP

稱取10.00 g預(yù)處理后的紅棗粉放入三角瓶中，加入純凈水溶解（液料比為10∶1（mL/g）），加入酶制劑，攪拌均勻后置于MAS-II常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站，3 000 r/min離心10 min取上清液，洗滌濾渣后與上清液合并過濾濃縮至50 mL備用。

提取工藝流程：紅棗粉（10 g）→加酶制劑→設(shè)定微波輔助水酶法處理條件（液料比10∶1（mL/g），儀器攪拌速率300 r/min）→離心分離→cAMP提取物。

1.3.3 紅棗中cAMP測定

1.3.3.1 高效液相色譜法

采用高效液相色譜法進(jìn)行測定：色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10∶90，V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取cAMP的對照品適量，精密稱定，加超純水配制成1.00 mg/mL的混合儲備液，于4 ℃保存；使用時用超純水稀釋，配制成cAMP質(zhì)量濃度為0.01、1.00、10.00、50.00、100.00、500.00、1 000.00 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.3.3 樣品cAMP提取量的測定

將cAMP提取液定容到50 mL后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，再用微量進(jìn)樣器吸取20 μL注入高效液相色譜儀，將色譜圖積分后記錄峰面積，外標(biāo)法計算，得樣品cAMP提取量。cAMP提取量計算見下式：

1.3.4 單因素試驗

在前期查閱文獻(xiàn)及預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選取對cAMP提取量影響較大的因素如酶添加量、酶解溫度、酶解時間、微波功率等進(jìn)行單因素試驗。單因素試驗對應(yīng)的固定條件為酶添加量1.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間30 min、微波功率400 W，實驗重復(fù)3 次。各因素與水平見表1。

表1 單因素試驗因素與水平Table 1 Levels of independent variables used in one-factor-at-a-time design

1.3.5 響應(yīng)面試驗

通過前期實驗及單因素試驗結(jié)果，確定在pH 5、液料比10∶1（mL/g）及攪拌速率300 r/min的條件下，研究酶添加量、酶解溫度、酶解時間和微波功率等因素對cAMP提取量的影響。根據(jù)Box-Behnken試驗原理進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。

1.3.6 cAMP抗疲勞實驗

1.3.6.1 小鼠實驗條件和分組

參照鄭飛[23]方法：本實驗供試小鼠飼喂條件為溫度（20±2）℃、相對濕度（50±5）%，采食和飲水均采用自由給予形式。通過基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)供試小鼠（50 只）1 周后以體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)分成5 組，具體見表2。

表2 實驗分組及灌胃劑量Table 2 Animal grouping and administration

1.3.6.2 力竭游泳實驗

本實驗最后給藥30 min后，小鼠尾部負(fù)重5%鉛絲，將供試小鼠分別置于恒溫水池箱（水深20～30 cm、水溫24～26 ℃）內(nèi)進(jìn)行力竭游泳實驗。供試小鼠放入后即刻計時，同時觀察小鼠情況并使小鼠始終處于運動狀態(tài)。秒表記錄小鼠自開始到沉于水下10 s后無法浮出水面的時間即為力竭游泳時間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)均以 ±s（n=3）表示，通過DPS V7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用LSD法，P＜0.05表示差異顯著；響應(yīng)面采用Design-Expert 7.1.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析并建立多元回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

按照1.3.3.1節(jié)色譜條件，將處理后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后自動進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)品cAMP在1.0～50.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)峰面積與樣品含量呈線性關(guān)系，回歸方程為y=0.557 5x＋0.637 5，回歸系數(shù)R2為0.999 3，回歸性較好。

圖1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（A）和紅棗提取樣品（B）的液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of cAMP reference standard and cAMP extracted from Chinese jujube

2.2 酶制劑種類對新疆紅棗中cAMP提取量的影響

圖2 纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶及其復(fù)配后對新疆紅棗中cAMP提取量的影響Fig. 2 Effects of cellulase, hemicellulase, pectinase and their mixture on the yield of cAMP

微波輔助酶法是通過物理機(jī)械作用與酶解技術(shù)相結(jié)合破壞植物細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞中活性成分釋放出來達(dá)到其含量增加的目的[18-19]。國內(nèi)外研究表明，通過采用纖維素酶、半纖維酶、果膠酶等生物酶制劑破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可提高紅棗中cAMP的提取量，在酶直接輔助提取cAMP的工藝中，生物酶的選擇是影響cAMP得率的關(guān)鍵因素[24]。本研究選用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶在酶添加量1.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間30 min、微波功率400 W的條件下進(jìn)行新疆紅棗中cAMP提取實驗。由圖2可知，與對照組（未添加酶制劑）相比，3 個酶單獨處理均可顯著提高新疆紅棗中cAMP的提取量（P＜0.05），但是3 種酶復(fù)合（纖維素酶-半纖維素酶-果膠酶質(zhì)量比1∶1∶1）處理新疆紅棗中cAMP的提取量較高，且與其他各組相比較，均具有顯著性差異（P＜0.05），因此選擇3 種酶的復(fù)合配比進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3 單因素試驗結(jié)果

圖3 單因素試驗對新疆紅棗中cAMP提取量的影響Fig. 3 Effect of various variables on the yield of cAMP

由圖3可知，隨著酶添加量的不斷增加，cAMP提取量呈現(xiàn)先上升隨后降低的趨勢，是因為酶添加量的增加提高了酶與底物的結(jié)合能力，加快了反應(yīng)速率，從而使紅棗cAMP提取量增加；當(dāng)達(dá)到臨界點2%時，此時反應(yīng)速率已達(dá)到最大；酶添加量1.5%和2%兩組處理相比無顯著性差異（P＞0.05），1.5%和2%酶添加量與其他3 組相比，差異顯著（P＜0.05），因此綜合統(tǒng)計學(xué)結(jié)果和成本考慮，確定酶添加量為1.5%；隨著酶解溫度的提高，cAMP提取量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。50 ℃后cAMP提取量下降是因為溫度高于臨界溫度后會抑制酶的活性，降低反應(yīng)速率，導(dǎo)致紅棗cAMP提取量降低；統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示溫度在50 ℃和60 ℃兩組相比，差異不顯著（P＞0.05），與其他組相比，差異顯著（P＜0.05），因此選擇溫度為50 ℃。綜合實驗結(jié)果及成本考慮，同理分析酶解時間和微波功率的單因素最佳水平為40 min和375 W。通過對單因素試驗結(jié)果分析，確定各因素的最佳水平分別為酶添加量1.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min、微波功率375 W進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平試驗設(shè)計及分析（表3和表4）。分析結(jié)果表明cAMP提取量影響因素中一次項A、B、C和D均表現(xiàn)出顯著水平，交互項僅AC、AD、BC、BD、CD表現(xiàn)出顯著水平，而二次項均表現(xiàn)出了顯著水平。因此建立多元二次回歸方程：

Y=509.44＋39.33A＋29.21B-37.38C＋24.89D＋10.52AB-34.80AC-58.63AD＋64.75BC-25.85BD-53.90CD-92.90A2-35.21B2-49.24C2-42.38D2

表3 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，上述方程模型極顯著（F=21.10，P＜0.000 1）且失擬項不顯著（F=5.33，P=0.060 5），說明該模型能較好地擬合實際值。對該方程進(jìn)行顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，其決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)分別為0.954 7和0.909 5，均大于0.90，說明模型相關(guān)度很好。

表4 新疆紅棗cAMP提取量回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation with the yield of cAMP as response variable

通過固定其他3 個因素條件為“0”水平，對建立的預(yù)測新疆紅棗中cAMP提取量回歸模型進(jìn)行降維分析，考察交互項對cAMP提取量的影響，經(jīng)軟件分析，可得響應(yīng)面試驗結(jié)果。由圖4可知，回歸模型存在穩(wěn)定點特征值，表明穩(wěn)定點為最大值點，等高線的形狀可反映出交互作用影響大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。通過等高線圖可以直觀看出AC、AD、BC、BD、CD兩因素交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。各因素最佳水平選擇在響應(yīng)面設(shè)計的0點水平較為合理。過高或過低的各因素水平對紅棗cAMP提取量均有不利的影響，單因素結(jié)果分析亦可得出相同結(jié)論。

圖4 新疆紅棗cAMP提取量的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various variables on the yield of cAMP

2.4.2 驗證實驗結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，微波輔助復(fù)配酶法提取紅棗cAMP最佳工藝參數(shù)為復(fù)配酶添加量1.5%、酶解溫度31.3 ℃、酶解時間20 min、微波功率500 W，理論計算提取量最大值為560.9 μg/g。在此條件下進(jìn)行驗證實驗，紅棗cAMP提取量為（551.6±18.4）μg/g，與模型預(yù)測值的相對誤差為1.66%。表明實驗所得回歸方程的最大預(yù)測值與驗證值非常接近，說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素的影響，建立的模型與實際情況比較吻合。

2.5 新疆紅棗cAMP提取物對衰老小鼠力竭游泳時間的影響結(jié)果

表5 各組小鼠 30 min內(nèi)的力竭游泳時間比較（n=50）Table 5 Effect of the cAMP on exhaustive swinging time in mice (n= 50)

小鼠負(fù)重游泳實驗是評價天然提取物抗疲勞作用的動物模型，若負(fù)重游泳時間越長，則表明測試物的抗疲勞效果越佳。力竭游泳時間可以充分反映動物機(jī)體的耐力，是目前評價疲勞狀態(tài)較為客觀的指標(biāo)[13]。構(gòu)建衰老模型目前主要采用老齡動物、D-半乳糖、臭氧損傷、去胸腺或其他藥物等方法[25-30]，其中由于D-半乳糖造模容易、實驗周期較短已經(jīng)被廣泛用于動物機(jī)體的抗疲勞評價[31-32]。本實驗通過D-半乳糖致小鼠衰老模型，評價cAMP的抗疲勞效果。由表5可知，各組動物在30 min內(nèi)均無死亡，CN組和DC組差異顯著（P＜0.05），不同新疆紅棗cAMP劑量組小鼠力竭游泳時間均高于DC組，150、300 mg/（kg·d）劑量的cAMP組與CN組差異不顯著（P＞0.05），450 mg/（kg·d）劑量的cAMP組比CN組提高了30.6%，且與CN組具有顯著差異（P＜0.05），結(jié)果說明新疆紅棗cAMP可有效提高衰老小鼠的運動能力，延緩機(jī)體疲勞的出現(xiàn)。本實驗中，新疆紅棗cAMP各劑量組均可不同程度地延長D-半乳糖所致衰老模型小鼠的力竭游泳時間，表明新疆紅棗cAMP可以提高小鼠的運動耐力，具有抗疲勞作用。

3 結(jié) 論

微波輔助水酶法是通過兩者直接的協(xié)同作用破壞植物細(xì)胞壁達(dá)到其含量增加的目的。本研究采用Design-Expert軟件通過Box-Behnken試驗設(shè)計獲得了微波輔助復(fù)配酶法提取新疆紅棗中cAMP的最佳工藝條件為復(fù)配酶（纖維素酶-半纖維素酶-果膠酶質(zhì)量比1∶1∶1）添加量1.5%、酶解溫度31.3 ℃、酶解時間20 min、微波功率500 W，在此條件下新疆紅棗cAMP提取量預(yù)測值達(dá)到最大值560.9 μg/g。

疲勞是主觀上的一種不適感覺，但客觀上會在同等條件下影響其完成原來所從事的正?；顒踊蚬ぷ髂芰??？蛊诰褪峭ㄟ^一些方法手段來抵消這種疲勞的感覺。本研究通過D-半乳糖造模，對供試小鼠進(jìn)行不同劑量的cAMP灌胃，同時以CN和DC組為對比進(jìn)行實驗。研究結(jié)果表明衰老小鼠力竭游泳時間與新疆紅棗中cAMP劑量呈正相關(guān)，而且450 mg/（kg?d）劑量的cAMP組的小鼠力竭游泳時間顯著高于CN組，比CN組提高了30.6%（P＜0.05），該結(jié)論與劉慶春等[3]研究結(jié)果相一致。結(jié)果說明新疆紅棗中cAMP可顯著提高衰老小鼠的運動能力，延緩疲勞的發(fā)生。

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Optimization of Microwave-Assisted Aqueous Enzymatic Extraction of Cyclic Adenosine 3’,5’-Monophosphate
(cAMP) from Chinese Jujube (Ziziphus jujuba Mill.) and Its Anti-Fatigue Effect

REN Yanrong1,2, ZHANG Zhongming3, XIE Yuejie1, XIONG Zhengwei1,2, WANG Zhongming1, WU Hongbin4,*
(1. College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;2. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing University of Education, Chongqing 400067,China; 3. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 737100, China; 4. Institute of Agro-Food Science and Technology, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, China)

Response surface methodology was used to optimize the microwave-assisted aqueous enzymatic extraction of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP) from Chinese jujube (Zizyphus jujuba Mill.) grown in Xinjiang. The antifatigue effect of the cAMP extracted was investigated. The optimal extraction conditions was found as follows: enzyme concentration 1.5% (a mixture of cellulase, hemicellulase and pectinase, 1:1:1 (m/m)), temperature 31.3 ℃, time 20 min and microwave power 500 W. Under these conditions, the yield of cAMP was 560.9 μg/g. The results showed that the cAMP could extend exhaustive swimming time and enhance swimming endurance in mice, suggesting good anti-fatigue effect.Therefore, cAMP holds great promise for its application in the food and pharmaceutical industry.

Zizyphus jujuba; cyclic adenodsine 3’,5’-monophosphat (cAMP); microwave-assisted aqueous enzymatic extraction; swimming time

10.7506/spkx1002-6630-201802041

TS255

A

1002-6630（2018）02-0260-07

任彥榮, 張忠明, 謝躍杰, 等. 微波輔助水酶法優(yōu)化紅棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)提取工藝及其抗疲勞作用[J]. 食品科學(xué),2018, 39(2): 260-266.

10.7506/spkx1002-6630-201802041. http://www.spkx.net.cn

REN Yanrong, ZHANG Zhongming, XIE Yuejie, et al. Optimization of microwave-assisted aqueous enzymatic extraction of cyclic denosine 3’,5’-monophosphate (cAMP) from Chinese jujube (Ziziphus jujuba Mill.) and its anti-fatigue effect[J]. Food Science,2018, 39(2): 260-266. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802041. http://www.spkx.net.cn

2017-03-24

新疆建設(shè)兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)項目（2015AB030）；重慶市五大功能區(qū)域創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊建設(shè)項目（201618793）

任彥榮（1980—），女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物分析。E-mail：cqueryr@126.com

*通信作者簡介：吳洪斌（1980—），男，副研究員，碩士，研究方向為果蔬農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：woo2007@foxmail.com