朱雅慧，朱洪日，王佳瑩，張公亮，郝洪順，侯紅漫*

三文魚基質上單核細胞性李斯特菌毒力因子的表達

朱雅慧，朱洪日，王佳瑩，張公亮，郝洪順，侯紅漫*

（大連工業(yè)大學 遼寧省水產(chǎn)品加工質量安全與控制重點實驗室，遼寧 大連 116034）

為了解單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）污染食品基質后毒力因子表達的變化，本研究以Lm標準株ATCC 19115為研究對象，將其接種于三文魚基質及胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（tryptic soy agar-yeast extract，TSA-YE）（對照組）上，于0、4、7 ℃貯藏條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h后，收集菌體提取總RNA，采用反轉錄實時定量聚合酶鏈式反應（reverse transcript-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）對其4 個毒力因子hlyA、inlB、prfA、sigB的表達進行分析。結果表明，在0、4 ℃和7 ℃分別培養(yǎng)24 h和48 h后，4 個主要毒力因子在三文魚基質上的表達量均高于平板對照，其中hlyA在貯藏4℃的三文魚基質上表達上調的最為顯著。此外，prfA和sigB在4 ℃貯藏條件下，表達量極顯著高于7 ℃和0 ℃（P＜0.01）；在不同的溫度貯藏24 h，inlB和hlyA的表達量均表現(xiàn)為7 ℃＞4 ℃＞0 ℃（P＜0.01）；且4 個主要毒力因子在三文魚基質上的相對表達量均表現(xiàn)為48 h＞24 h（P＜0.01）。綜上所述，本研究為該菌在食品基質上的風險評估和有效防控提供一定的理論依據(jù)。

單核細胞性李斯特菌；毒力因子；三文魚基質

單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是國際公認的四大食源性致病菌之一[1]，在自然環(huán)境中廣泛存在，對于極端的環(huán)境脅迫均有一定的耐受力[2-3]。Lm在冷藏溫度（0～4 ℃）條件下也可生長，零售商銷售冷藏食品時的溫度多為7 ℃。因此，該菌對冷藏即食食品的安全構成嚴重威脅[4-6]。作為主要冷藏食品之一的三文魚，其食用安全性很大程度上受到Lm的影響[7-8]。歐盟一項調查顯示，被Lm污染的生三文魚的致病率通常在0%～10%[9-10]。在美國每年約有1 600 人因Lm而患病，約260 人死亡[11]。1990—2006年即食海鮮在即食食品中的召回率最高，且近年來，美國和加拿大發(fā)生多起被Lm污染的冰鮮和煙熏三文魚被召回事件，而2015年在中國香港生產(chǎn)的一批三文魚由于Lm污染而被召回[12]。

關于Lm毒力基因表達量的研究，多集中于將Lm接種于培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，然而培養(yǎng)基的成分與食品基質有一定差異，培養(yǎng)基無法完全模擬微生物在食品基質上的生長和毒力基因表達情況[13-15]。近年來，關于將Lm接種于食品基質上進行培養(yǎng)后，研究其生長和毒力的相關研究不斷增加，這些報道多模擬肉制品、乳制品及蔬菜水果等基質[16-19]。然而，對于Lm在水產(chǎn)品基質上培養(yǎng)后，觀察其毒力基因變化的相關報道仍相對較少[20]。

鑒于此，本研究以Lm標準菌株ATCC 19115為主要研究對象，將其接種于三文魚基質上，于0、4、7 ℃貯藏條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h，以Lm主要毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB為研究對象，利用反轉錄實時定量聚合酶鏈式反應（reverse transcript-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的方法對inlB、hlyA、prfA、sigB的表達進行研究，有助于更好地了解食品基質和貯藏溫度對于Lm毒力基因表達的影響，從而為進一步探究Lm致病機理和高效防控Lm提供相關的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

Lm ATCC 19115購于中國普通微生物菌種保藏中心，該菌株為強毒株，致病型為腦膜炎等，血清型4b，人源；三文魚塊購自沃爾瑪超市。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB）、酵母浸粉（yeast extract，YE）、瓊脂粉大連博諾公司；Ex Taq Mixture、SYBR Premix Ex Taq、Random Primer、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H-） 寶生物工程（大連）有限公司；細菌DNA提取試劑盒、細菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；相關基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNaseⅠ 美國Thermo Scientif i c公司。

1.2 儀器與設備

UV2102型紫外分光光度計 島津（上海）儀器有限公司；Centrifuge 5418小型臺式離心機 德國艾本德公司；Gel DocTMXR＋凝膠成像儀、MaxygeneⅡPCR儀、MyiQTM2熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 生魚片的制備

用滅菌后的手術刀將三文魚切割成10～15 g/塊，滅菌PBS清洗魚肉表面3 次，清除魚肉上雜菌，備用。

1.3.2 菌種活化及菌液制備

取Lm ATCC 19115菌株-80 ℃凍存的菌液50 μL加入到5 mL TSB-0.6%YE中培養(yǎng)，將上述活化后的菌液劃線于TSA-0.6%YE平板，37 ℃培養(yǎng)后，挑取單菌落至10 mL的TSB-0.6%YE中，37 ℃培養(yǎng)20 h（OD600nm約為1.0），該菌液作為種子菌液用于后續(xù)的實驗。

取4 mL上述種子菌液離心，用200 μL PBS吹懸，吹懸后的菌液（109CFU/mL）接種于三文魚魚肉基質及TSA-YE平板上，分別置于0、4、7 ℃培養(yǎng)24 h和48 h，每個處理組3 個重復。

1.3.3 引物的設計及驗證

利用Fast PCR軟件進行hlyA引物的設計與評價，并利用NCBI BLAST對于設計的引物進行進一步的評價。選擇的引物在18～27 個堿基；以G/C開頭，GC百分比在45%～55%；Tm值在50～60 ℃之間，且上下游引物的Tm值相差不得超過3 ℃；不產(chǎn)生二級結構、發(fā)夾結構；Quality值大于90或95。其他3個毒力基因的引物來自參考文獻，引物序列見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in the present study

1.3.4 DNA的提取及主要毒力因子的驗證

取適量菌液按照細菌DNA提取試劑盒說明書步驟進行DNA的提取，以該DNA作為模板，使用4 個主要毒力因子inlB、prfA、hlyA和sigB的引物進行基因擴增。擴增體系為20 μL，Premix Taq 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1μL，ddH2O 7 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增32個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

1.3.5 RNA的提取及純化

用10 mL PBS將Lm從三文魚塊上洗脫下來，洗脫下來的菌液按照細菌RNA提取試劑盒說明書步驟稍作改動后，進行RNA的提取，由于是在食品基質上進行Lm的培養(yǎng)，所以提取的RNA有明顯的DNA污染，為減小DNA對于后續(xù)實驗的影響，使用DNaseⅠ對提取的RNA進行處理，向提取的RNA 1 μg中加入1 U DNaseⅠ和1 μL buffer，37 ℃水浴30 min，再加入1 μL EDTA，65 ℃水浴10 min。

1.3.6 RT-qPCR分析

反轉錄采用兩步法，第1步反轉錄體系為：RNA模板5 μL；Random Primers[pd(N)6] 1 μL；體系共計6 μL。反轉錄條件為：70 ℃ 10 min；4℃ 2 min；4 ℃ ∞。第2步反轉錄體系為：第1步RNA變性溶液6 μL；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）0.5 μL；5×M-MLV Buffer 2 μL；dNTP Mixture 0.5 μL；Recombinant RNase Inhibitor 0.25 μL；RNase-free Water 0.75 μL；體系共計10 μL。反轉錄條件為：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min；4 ℃ 2 min；4 ℃ ∞。

熒光定量PCR體系（共25 μL）：SYBR? Premix Ex TaqTM12.5 μL；引物（10 μmol/L）各0.5 μL；RNasefree Water 9.5 μL；cDNA模板 2 μL。反應參數(shù)：95 ℃30 min；95 ℃ 5 s，63.3 ℃ 25 s，72 ℃ 15 s，于80 ℃處停留15 s，收集熒光信號，反應40 個循環(huán)；并在60～95 ℃范圍建立熔解曲線。根據(jù)得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法[25]對于不同條件下毒力基因表達的差異進行計算和分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗需要進行顯著性差異分析的，實驗結果以3 個平行結果的表示。用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 引物及主要毒力基因的驗證

圖1 Lm ATCC 19115主要毒力因子的PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1 PCR amplif i ed products of major virulence factors of Lm ATCC 19115

以Lm ATCC 19115的cDNA為模板，將合成的cDNA模板10 倍稀釋成8 個梯度，進行熒光定量PCR擴增，系統(tǒng)自動生成的標準曲線方程為y=-3.621x＋10.53，擴增效率為88.9%，回歸相關系數(shù)r2為0.991，hlyA的溶解曲線只出現(xiàn)單一的信號峰，沒有產(chǎn)生非特異性條帶及引物二聚體，設計的hlyA引物可以用于進一步的實驗。

對Lm ATCC 19115主要毒力因子的PCR檢測結果如圖1所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，hlyA、inlB、prfA和sigB均在預期大小的位置得到相應的條帶，由此可知Lm ATCC 19115含有這4 種主要的毒力因子。

2.2 RNA的提取及純化

圖2 純化前（A）、后（B）Lm ATCC 19115 RNA提取及純化Fig. 2 Electrophoresis of crude and purif i ed RNA from Lm ATCC 19115

將三文魚基質上和平板上的Lm沖洗下來提取的RNA，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳進行檢測，結果如圖2A所示，提取的總RNA、23S和16S rRNA條帶較清晰，但有明顯的拖尾現(xiàn)象，表明有DNA等雜質的污染。將上述樣本用DNA酶純化后，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳進行檢測，結果見圖2B，在RNA完整性保存良好的同時幾乎不存在DNA污染，且OD260nm/OD280nm為1.8～2.1，RNA純化處理成功，可以進行后續(xù)實驗。

2.3 三文魚基質上毒力因子的表達水平分析

如圖3所示，Lm ATCC 19115在魚肉基質上，0、4、7 ℃培養(yǎng)24 h和48 h，inlB、hlyA、prfA、sigB的相對表達量均上調。其中hlyA在貯藏48 h的三文魚基質上的表達上調最為顯著，由此可知，與平板相比，魚肉基質能夠一定程度地增加毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB的表達量。

圖3 三文魚基質對Lm毒力基因表達的影響Fig. 3 Inf l uence of salmon matrix on virulence genes expression of Lm

圖4 溫度對三文魚基質上Lm毒力基因表達的影響Fig. 4 Inf l uence of temperature on virulence genes expression of Lm grown in salmon matrix

如圖4所示，在三文魚基質上，隨著溫度的升高，inlB和hlyA這兩個毒力因子相對表達量的變化趨勢一致，24 h均表現(xiàn)為7 ℃＞4 ℃＞0 ℃（P＜0.01），48 h兩個基因均表現(xiàn)出4 ℃的相對表達量大于0 ℃和7 ℃的相對表達量；prfA在24 h和48 h毒力基因的相對表達量均為4 ℃最高，0 ℃的相對表達量最低。環(huán)境調控因子sigB 24 h的相對表達量呈現(xiàn)出一定的低溫促進趨勢，0 ℃和4 ℃的相對表達量均顯著高于7 ℃的相對表達量（P＜0.01），sigB 48 h的相對表達量與prfA的相對表達量變化趨勢相同。

圖5 培養(yǎng)時間對三文魚基質上Lm毒力基因表達的影響Fig. 5 Inf l uence of culture duration on virulence gene expression of Lm grown in salmon matrix

如圖5所示，Lm ATCC19115菌株在三文魚基質上，在0、4 ℃和7 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB的相對表達量較24 h均呈現(xiàn)出上調的趨勢。由此可知，貯藏時間的延長，一定程度上可增加毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB的表達量。

3 討 論

有研究表明，食品的成分、性質都會影響Lm的毒力，因此本研究將Lm標準株ATCC 19115接種于三文魚基質上，不同溫度培養(yǎng)，應用RT-qPCR技術對培養(yǎng)后主要毒力因子的表達量進行檢測及分析。從結果來看，與平板相比，在不同貯藏溫度（0、4、7 ℃）和不同貯藏時間（24、48 h）條件下，毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB的相對表達量均上調。Hadjilouka等[26]將Lm（LQC 15257）接種于香瓜、芝麻菜和肉湯中進行培養(yǎng)，也得到了相同的結果，與純培養(yǎng)的肉湯相比，毒力因子inlB、hly的相對表達量均上調。Olesen等[27]的研究也表明，一些食品本身的性質會影響Lm（EGD-e、4140）的毒力基因表達，從而影響Lm的毒力。本研究中，三文魚基質上，不同溫度貯藏24 h，inlB和hlyA的相對表達量表現(xiàn)為7 ℃＞4 ℃＞0 ℃，溫度的升高能夠增加毒力因子inlB、hlyA的表達量；在三文魚基質上，sigB則表現(xiàn)為4 ℃≈0 ℃＞7 ℃。Alessandria等[28]將7 株Lm接種于奶酪上，4、12 ℃培養(yǎng)24 h和48 h，對于有些菌株來說，與4℃相比12 ℃也使hlyA的表達上調。Rantiou等[29]將3株Lm（分離自肉#3、來自實驗室NCTC 10527、分離自奶酪#162）分別接種到發(fā)酵香腸、肉末、奶酪、高溫瞬時滅菌牛乳中培養(yǎng)，其中兩株Lm（#3、NCTC 10527）在肉沫中培養(yǎng)后，hlyA的表達量表現(xiàn)為12 ℃＞4 ℃；兩株Lm（#3，#162）在香腸中培養(yǎng)后，sigB的表達量表現(xiàn)為4 ℃＞12 ℃，造成這種現(xiàn)象的原因可能是不同菌株的來源、血清型不同，且接種的食品基質本身的性質也不同，導致不同菌株的毒力基因在不同的基質上表達出現(xiàn)差異，沒有得到相似的規(guī)律。Larsen等[30]將Lm（DSMZ 15675）接種于奶酪上培養(yǎng)24 h和48 h，發(fā)現(xiàn)在相同鹽濃度條件下，hly和inlA在48 h的相對表達量大于24 h。在本研究中也得到相似的結果，與24 h相比，在三文魚基質上不同溫度貯藏（0、4、7 ℃）48 h，毒力因子inlB、hlyA、prfA、sigB的相對表達量均上調。但Duodu等[20]將2株Lm（CCUG 3998、442）接種于鮭魚上，0、4、20 ℃培養(yǎng)24 h和48 h，發(fā)現(xiàn)在相同溫度下，hlyA和inlA在24 h和48 h的相對表達量沒有顯著差異，造成這種現(xiàn)象的原因可能是菌株和實驗條件方面的差異。

由此可見，影響Lm毒力基因表達的因素很多，除Lm本身調控因子對于毒力因子的調控外，還與貯藏溫度、時間、培養(yǎng)基質、菌株的血清型、致病力、來源和環(huán)境適應能力有一定的相關性。若要更深入了解Lm毒力基因的表達，還需要進行進一步的探索和研究。綜上，本研究對于Lm在三文魚基質上培養(yǎng)后毒力因子和調控因子的表達進行了分析，通過毒力基因表達量間接推斷毒力的變化，為進一步研究降低和抑制Lm的毒力提供了理論支持。

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Virulence Gene Expression of Listeria monocytogenes Grown in Salmon Matrix

ZHU Yahui, ZHU Hongri, WANG Jiaying, ZHANG Gongliang, HAO Hongshun, HOU Hongman*
(Liaoning Key Lab for Aquatic Processing Quality and Safety, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

The aim of the present study was to assess the inf l uence of storage temperature on virulence gene expression of Listeria monocytogenes (Lm) grown in a food matrix. Lm ATCC 19115 was grown in a salmon matrix or tryptone soya agar containing 0.6% yeast extract (TSA-YE) (control) at different temperatures (0, 4 and 7 ℃) for 24 and 48 h, respectively.Then, the bacterial cells were collected by centrifugation for RNA extraction using a commercial kit (TianGen, Dalian),and the expression levels of hlyA, inlB, prfA and sigB were assessed by RT-qPCR. The RT-qPCR data showed that the expression of all four major virulence genes was up-regulated when the strain was grown in a salmon matrix compared to TSA-YE at each temperature. In addition, hlyA possessed the highest expression level among these four genes. The expression levels of prfA and sigB in Lm from salmon stored at 4 ℃ were signif i cantly higher than those at 0 and 7 ℃(P ＜ 0.01). The expression levels of inlB and hlyA in salmon stored for 24 h at different temperatures were in the descending order of 7 ℃ ＞ 4 ℃ ＞ 0 ℃ (P ＜ 0.01). In the salmon matrix, the expression levels of all four major virulence genes at 48 h were signif i cantly higher than those at 24 h (P ＜ 0.01). The results of this study can provide basic information for risk assessment and control of Lm in food matrices.

Listeria monocytogenes; virulence genes; salmon matrix

10.7506/spkx1002-6630-201802022

TS201.1

A

1002-6630（2018）02-0138-06

朱雅慧, 朱洪日, 王佳瑩, 等. 三文魚基質上單核細胞性李斯特菌毒力因子的表達[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 138-143.

10.7506/spkx1002-6630-201802022. http://www.spkx.net.cn

ZHU Yahui, ZHU Hongri, WANG Jiaying, et al. Virulence gene expression of Listeria monocytogenes grown in salmon matrix[J]. Food Science, 2018, 39(2): 138-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802022.http://www.spkx.net.cn

2017-01-12

遼寧省自然科學基金項目（201602049）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD17B00）

朱雅慧（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：15840684346@163.com

*通信作者簡介：侯紅漫（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：houhongman@dlpu.edu.cn