張香美，趙玉星，閆曉晶，崔 娜

1 株具抑菌和抗氧化活性乳酸菌的篩選及鑒定

張香美，趙玉星，閆曉晶，崔 娜

（河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061）

從市售酸泡菜中分離純化乳酸菌，以植物乳桿菌PL2、大腸桿菌As1.184等為指示菌篩選具有抑菌活性的乳酸菌；以對(duì)1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·OH、O2-·清除率為指標(biāo)，進(jìn)一步篩選高抗氧化活性菌株。結(jié)果表明：從市售酸菜中分離篩選出8 株兼具抑菌活性和抗氧化活性的乳酸菌菌株，其中菌株b-2的抑菌活性和抗氧化活性最強(qiáng)，根據(jù)生理、生化和分子生物學(xué)特征將其鑒定為植物乳桿菌?？寡趸钚詼y(cè)定結(jié)果顯示，該菌株的無細(xì)胞提取物對(duì)·OH的清除率最高，為67.6%；其完整細(xì)胞對(duì)O2-·的清除活性最強(qiáng)，清除率為62.8%；其無細(xì)胞發(fā)酵上清液對(duì)DPPH自由基清除率高達(dá)91.3%。植物乳桿菌b-2具有較好的抑菌能力和抗氧化能力，作為功能性乳酸菌發(fā)酵劑，具有十分重要的開發(fā)潛力。

抗氧化；抑菌；乳酸菌；篩選；鑒定

乳酸菌發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于酸奶、泡菜、發(fā)酵肉等的生產(chǎn)。具有抑菌能力的乳酸菌發(fā)酵劑可以更好地控制發(fā)酵過程，提高食品安全性，引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[1-2]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌菌株具有抗氧化、抗衰老等重要生物學(xué)功能[3-6]，在保障食品質(zhì)量、提高食品品質(zhì)方面具有重要作用，是開發(fā)功能性乳酸菌發(fā)酵劑的重要資源。功能性乳酸菌發(fā)酵劑在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用潛力巨大[7-10]。開發(fā)同時(shí)具有抑菌和抗氧化功能的乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)于提高食品安全和質(zhì)量具有重要價(jià)值。

具有多重功能的乳酸菌的篩選已成為微生物發(fā)酵劑研究的新趨勢(shì)。Arasu等[11]從傳統(tǒng)泡菜中分離到1 株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）P68，該菌株具有抗真菌和抗氧化活性，并具有益生特性。Mikelsaar等[12]報(bào)道了1 株具有抑菌和抗氧化雙重功能的發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）ME-3，該菌株可以增加血清的抗氧化能力并具有顯著的抗動(dòng)脈粥樣化作用，其產(chǎn)品已在波羅的海國家和芬蘭成功上市銷售，但國內(nèi)尚鮮見相關(guān)的報(bào)道。本研究擬從發(fā)酵酸泡菜樣品中分離篩選具有抑菌和抗氧化雙重活性的乳酸菌菌株，為乳酸菌功能食品的開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售酸菜（阿花酸菜、康師傅老壇酸菜包、雅園菜業(yè)四阿哥重慶魚酸菜）。

植物乳桿菌PL2為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營養(yǎng)工程學(xué)院李平蘭教授贈(zèng)送；大腸桿菌As1.184、銅綠假單胞菌P1、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌As1.72均來自河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）StarMix 北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

759CKT紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；CX41-32L02型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

稱取樣品25 g，加入到225 mL的無菌生理鹽水中，振蕩均勻，用無菌生理鹽水10 倍稀釋，選擇3 個(gè)適宜稀釋度，分別取200 μL稀釋液涂布于MRS（含0.5%碳酸鈣）培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取具有溶鈣圈的單菌落，反復(fù)多次劃線直至獲得純培養(yǎng)。

1.3.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

1.3.2.1 初篩

將純化的乳酸菌菌株，以1%的接種量（終濃度為107CFU/mL）接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，10 000×g離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾，即為無細(xì)胞上清液（cell-free supernatants，CFS），以植物乳桿菌PL2為指示菌，采用杯碟方法測(cè)定該CFS的抑菌活性[13]。

1.3.2.2 復(fù)篩

將初篩獲得的抑菌效果好的乳酸菌菌株，按1.3.2.1節(jié)方法制備無細(xì)胞發(fā)酵上清液，參照張旭等[14]方法制備抑菌物質(zhì)粗提物。以植物乳桿菌PL2、大腸桿菌As1.184、銅綠假單胞菌P1、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌As1.72為指示菌。植物乳桿菌PL2用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他指示菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。用無菌生理鹽水將活化好的各指示菌活菌數(shù)調(diào)整為106CFU/mL，采用杯碟方法測(cè)定各菌株抑菌物質(zhì)粗提物的抑菌活性，對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 具有抗氧化活性乳酸菌的篩選及抗氧化活性測(cè)定

將經(jīng)上述步驟篩選到的具有抑菌活性的乳酸菌菌株，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，10 000×g離心5 min，分別收集上清液和菌體沉淀。CFS的制備參照1.3.2.1節(jié)方法。將菌體沉淀用無菌水洗滌2 次，重懸菌體細(xì)胞，調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL。將所得菌懸液分為兩組，一組用作完整細(xì)胞（intact cells，IC），另一組用超聲冰浴破碎，鏡檢沒有完整菌體后，在4 ℃條件下10 000×g離心10 min，收集上清液即為無細(xì)胞提取物（cell free extracts，CFE）。

1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[4,15]的方法。取1 mL樣品，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，并在10 000 r/min離心1 min，取上清液在517 nm波長處測(cè)定吸光度。空白組以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。DPPH自由基清除率計(jì)算見式（1）：

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

羥自由基（·OH）清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]的方法，稍加改進(jìn)。取鄰菲啰啉（0.75 mmol/L）1 mL于試管中，依次加入PBS（pH 7.4）2 mL，蒸餾水1 mL，充分混勻后，加入FeSO4溶液（2.5 mmol/L）1 mL，混勻加H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%）l mL，在37 ℃水浴1.5 h后在536 nm波長處測(cè)定其吸光度Ap；用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2測(cè)定其吸光度Ab；用1 mL樣品代替1 mL的蒸餾水測(cè)定其吸光度As。·OH清除率計(jì)算見式（2）：

超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[17-18]的方法，略有改進(jìn)。取3 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）于試管中，依次加入1 mL 3 mmol/L二乙三胺五乙酸、1 mL 1.2 mmol/L鄰苯三酚，充分混勻，加入0.5 mL所測(cè)樣品，混勻。于25 ℃反應(yīng)10 min后，在325 nm波長處測(cè)吸光度。O2-·清除率計(jì)算見式（3）：

式中：A00為不含樣品和鄰苯三酚吸光度；A01為不含樣品、含鄰苯三酚吸光度；A10為含樣品、不含鄰苯三酚吸光度；A11為含樣品和鄰苯三酚吸光度。

以上抗氧化活性測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.3.4 菌株的鑒定

1.3.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

挑取少量的目標(biāo)菌株于MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，觀察個(gè)體形態(tài)。

1.3.4.2 生理生化鑒定

采用生化鑒定試劑盒進(jìn)行糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4.3 16S rDNA鑒定

采用TIANamp Bacteria DNA kit（天根生化科技（北京）有限公司）提取基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板，采用通用引物序列LPW57：5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；LPW205：5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系及反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[20]。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收純化目的片段，連接 pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。將經(jīng)菌落PCR鑒定正確的重組子送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將PCR產(chǎn)物序列測(cè)定結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4.4 基于recA基因的PCR鑒定

以菌株總基因組DNA為模板，參照Torriani等[21]方法進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增recA基因，以植物乳桿菌PL2和類植物乳桿菌L-ZS9基因組DNA為模板作對(duì)照。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從3 種市售酸菜中共分離純化到83 株溶鈣圈較大的菌株，編號(hào)為a-1、a-2……a-27，b-1、b-2……b-28，c-1、c-2……c-28。具有溶鈣圈菌落見圖1。

圖1 具有溶鈣圈菌落圖Fig. 1 Colonies with dissolving calcium carbonate ring

2.2 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

以植物乳桿菌PL2為指示菌，經(jīng)過初篩共獲得具有抑菌活性的乳酸菌18 株；進(jìn)一步以植物乳桿菌PL2、大腸桿菌As1.184等為指示菌復(fù)篩，得到8 株對(duì)供試指示菌均呈抑菌活性的乳酸菌菌株，分別為a-1、b-1、b-2、b-4、b-5、b-6、c-3、c-4，各菌株對(duì)指示菌的抑菌效果見表1，其中菌株b-2、c-3對(duì)供試菌抑菌效果最佳。

表1 各菌株對(duì)指示菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of 8 isolates against indicator bacteria

2.3 具有抗氧化活性乳酸菌的篩選

2.3.1 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)篩選出的8 株乳酸菌菌株的IC、CFE、CFS組均具有不同程度的DPPH自由基清除能力。IC組DPPH自由基清除能力強(qiáng)的菌株為b-2、b-4、b-5、c-3；CFE組DPPH自由基清除率高的菌株有b-2、b-1；CFS組DPPH自由基清除能力強(qiáng)的菌株為b-2、b-1。從總體看，菌株b-2對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其CFS處理組對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)91.3%，其IC組和CFE組對(duì)DPPH自由基清除率分別為34.8%和50%。菌株b-1對(duì)DPPH自由基清除能力次之。不同菌株CFS組的DPPH自由基清除能力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其IC組和CFE組，說明各菌株的DPPH自由基清除能力很可能主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中，而其IC和CFE也可起到一定的DPPH自由基清除作用。

圖2 各菌株對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig. 2 DPPH radical-scavenging ability of 8 screened strains

2.3.2 ·OH清除率測(cè)定結(jié)果

圖3 各菌株對(duì)·OH的清除效果Fig. 3 Hydroxyl radical-scavenging ability of 8 screened strains

由圖3可知，b-2菌株對(duì)·OH的清除率最高，其次是c-4菌株。b-2菌株的CFE組對(duì)·OH清除率（67.6%）遠(yuǎn)超出其他菌株。IC組中，b-2菌株對(duì)·OH的清除率最高，為60.9%；其次是c-4菌株，為42.2%。CFS組中，b-2對(duì)·OH的清除率最高，為34.8%；其次為b-1，·OH清除率為29.2%。從總體看，不同處理對(duì)·OH的清除能力有很大差異，b-2及c-4菌株CFE、IC組的·OH清除能力高于CFS組，說明這兩株菌的·OH清除活性成分主要存在于其胞內(nèi)成分和完整菌體中。

圖4 各菌株對(duì)·的清除效果Fig. 4 Superoxide anion radical-scavenging ability of 8 selected strains

綜合抑菌性能和抗氧化性能測(cè)定結(jié)果，選擇b-2菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 菌株鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

圖5 菌株b-2形態(tài)Fig. 5 Morphology of strain b-2

菌株b-2呈乳白色圓形菌落，直徑1～2 mm，表面光滑凸起；菌株b-2為革蘭氏陽性直的或彎的短桿菌，單個(gè)、成對(duì)或成短鏈狀，無鞭毛，無芽孢，兼性厭氧。菌株b-2個(gè)體形態(tài)見圖5。該菌株觸酶實(shí)驗(yàn)陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性、不液化明膠、不產(chǎn)生硫化氫氣體、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、無運(yùn)動(dòng)性，結(jié)果見表2。根據(jù)以上結(jié)果，對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步將b-2菌株鑒定為乳桿菌屬細(xì)菌。

表2 b-2菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identi fi cation of strain b-2

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)連接pEASY-T3載體測(cè)序，得到長度為1 520 bp的b-2菌株16S rDNA序列（GenBank accession No.SUB2181920 Strain KY357305）。用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，b-2菌株與植物乳桿菌處于同一個(gè)小分支，親緣關(guān)系最近，這與形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致，由此可以進(jìn)一步將b-2菌株歸屬于植物乳桿菌（L. plantarum）。

圖6 菌株b-2基于16 S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of strain b-2 based on 16S rDNA gene sequences

以b-2菌株基因組DNA為模板，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增recA基因，獲得約與植物乳桿菌PL2 recA基因PCR產(chǎn)物（318 bp）處于同一位置的條帶（圖7），而對(duì)照菌株類植物乳桿菌 L-ZS9的PCR產(chǎn)物（107 bp）也與預(yù)期結(jié)果一致。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將b-2菌株鑒定為植物乳桿菌。

圖7 recA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 7 Electrophoresis of PCR amplif i ed recA

3 討 論

功能性乳酸菌發(fā)酵劑在改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味、增加食品的營養(yǎng)保健功效、提高食品的安全性、延長食品的貨架期等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[22-25]，在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用潛力巨大，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離功能性乳酸菌已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。

報(bào)道顯示[26]，許多乳酸菌，如嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、噬淀粉乳桿菌（L. amylovorus）、短乳桿菌（L. brevis）、棒狀乳桿菌（L. coryniformis）、瑞士乳桿菌（L. helveticus）、植物乳桿菌（L. plantarum）以及羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）等均具有抗氧化活性，但同時(shí)具有抑菌活性的菌株則僅見短乳桿菌P68和發(fā)酵乳桿菌ME-3。具有抗菌和抗氧化雙重功能的乳酸菌的在食品工業(yè)中具有非常重要的價(jià)值，因?yàn)樗鼈冊(cè)谧鳛榘l(fā)酵劑的同時(shí)還具有抑菌防腐及抗氧化功能，一方面可以穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，提高食品安全性，另一方面，又可賦予食品營養(yǎng)保健功能，在取代食品添加劑方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。

本課題組分離到的菌株b-2對(duì)供試的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等均具有較強(qiáng)抑菌效果，其CFE對(duì)·OH清除率為67.6%，其IC對(duì)·的清除率為62.8%；其CFS對(duì)DPPH自由基清除率則高達(dá)91.3%，在同類特性菌株中具有顯著優(yōu)勢(shì)，在食品、生物發(fā)酵等領(lǐng)域具有重要的價(jià)值，應(yīng)用潛力巨大。菌株b-2的體內(nèi)抗氧化效果還有待于進(jìn)一步測(cè)定。

研究發(fā)現(xiàn)菌株b-2的IC、CFE及CFS對(duì)DPPH自由基、·、·OH的清除能力存在較大差異，這可能是因?yàn)椴煌目寡趸钚猿煞执嬖谟诓煌幚斫M中；也可能與不同自由基的清除機(jī)理各不相同有關(guān)，吳祖芳等[30]認(rèn)為乳酸菌的抗氧化性能可能是因其不同且相對(duì)獨(dú)立的抗氧化機(jī)制所致。菌株b-2的DPPH自由基清除活性主要存在于其胞外代謝產(chǎn)物中，其·OH清除活性成分主要存在于胞內(nèi)成分和菌體中，其清除·的活性物質(zhì)主要存在于完整菌體，菌株b-2的抗氧化活性成分及其抗氧化機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Screening and Identif i cation of Lactic Acid Bacterium with Antimicrobial and Antioxidant Activity

ZHANG Xiangmei, ZHAO Yuxing, YAN Xiaojing, CUI Na
(College of Biology Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang 050061, China)

In this study, lactic acid bacteria were isolated from pickle samples. All the isolates were primarily screened for their antimicrobial activity against six indicator strains such as Lactobacillus plantarum PL2 and Escherichia coli As1.184.Then the scavenging activities against hydroxyl radicals, superoxide anion and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)radicals were measured to evaluate antioxidant activity of the isolates with antimicrobial activity. The results showed that eight strains with both antimicrobial and antioxidant activity were screened from pickles. The highest levels of antimicrobial activity and antioxidant activity were recorded in strain b-2, which was identified as L. plantarum by its physiological,biochemical and molecular characteristics. According to the results of antioxidant activity, the cell-free extract of b-2 showed the highest hydroxyl radical-scavenging activity, which scavenged 67.6% hydroxyl radical, while the intact cells exhibited the highest superoxide anion-scavenging activity, which scavenge 62.8% superoxide anion radical, and the highest DPPH radicalscavenging activity was seen in the cell-free supernatant, which scavenged 91.3% DPPH radical. To conclude, L. plantarum b-2 has good bacteriostatic ability and antioxidant capacity, and holds great potential as a functional lactic acid bacterial starter.

antioxidant activity; antimicrobial; lactic acid bacteria; screening; identif i cation

10.7506/spkx1002-6630-201802015

TS201.3

A

1002-6630（2018）02-0093-06

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802015. http://www.spkx.net.cn

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10.7506/spkx1002-6630-201802015. http://www.spkx.net.cn

2017-02-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471707）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD20131091）；河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)2016年度大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201611832041）

張香美（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：zxm_bio@126.com

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