錢正明 孫敏甜 李 華 劉瀟瀟 李文慶 李文佳

(1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，東莞，523850； 2 廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州，510180)

冬蟲夏草水提液和醇提液HPLC指紋圖譜分析

錢正明1孫敏甜1李 華2劉瀟瀟2李文慶1李文佳1

(1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，東莞，523850； 2 廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州，510180)

目的：建立冬蟲夏草水提液和醇提液的高效液相指紋圖譜。方法：采用高效液相色譜對(duì)20批冬蟲夏草和2批發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的水提液和醇提液進(jìn)行分析；并對(duì)所獲得的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度計(jì)算和聚類分析。結(jié)果：建立了冬蟲夏草水提液和醇提液指紋圖譜，水提液指紋圖譜確定了7個(gè)共有峰，醇提液指紋圖譜確定了8個(gè)共有峰；冬蟲夏草水提液和醇提液指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均顯示20批冬蟲夏草樣本的相似度系數(shù)大于0.9，2批發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的相似度系數(shù)小于0.9；冬蟲夏草水提液和醇提液共有峰聚類分析結(jié)果均顯示，20批冬蟲夏草與2批發(fā)酵冬蟲夏草菌粉分別聚為不同類。結(jié)論：本文所建立的方法穩(wěn)定可靠，可以對(duì)冬蟲夏草質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為其提高產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

冬蟲夏草；水提液；醇提液；高效液相；指紋圖譜

冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰的功效[1-3]。在我國(guó)主要分布于西藏、青海、四川等高海拔地區(qū)，由于其生長(zhǎng)環(huán)境的特殊，其野生資源量有限[4-6]。近年來隨著人民生活水平提高和保健養(yǎng)生意識(shí)的增強(qiáng)，消費(fèi)者對(duì)冬蟲夏草的需求越來越大，造成冬蟲夏草市場(chǎng)供不應(yīng)求，市場(chǎng)冬蟲夏草產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊，因此對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行全面質(zhì)量控制尤為重要[7-8]。中藥指紋圖譜是一種全面綜合的質(zhì)量控制方法，已被廣泛運(yùn)用于中藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制[9-13]。前期冬蟲夏草指紋圖譜研究報(bào)道，包括紅外指紋圖譜分析、核磁指紋圖譜分析、高效液相指紋圖譜分析和高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜分析[14-16]。其中高效液相色譜具有特征性強(qiáng)，儀器普及率高等優(yōu)點(diǎn)在冬蟲夏草指紋圖譜分析中得到了廣泛應(yīng)用，但前期冬蟲夏草液相指紋圖譜研究主要集中于對(duì)其水提液的指紋圖譜分析，這就會(huì)造成部分醇溶性化合物信息的缺失[17-19]。本文在前期文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)建立了冬蟲夏草水提液和醇提液液相指紋圖譜方法，為其產(chǎn)品的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD檢測(cè)器，Agilent化學(xué)工作站)；十萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水機(jī)(默克密理博)；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2004A)。

1.2 材料 甲酸(色譜純，阿拉丁)；甲醇(色譜純，SPECTRUM)；乙腈(色譜純，SPECTRUM)；水為超純水；冬蟲夏草及發(fā)酵冬蟲夏草菌粉樣品信息見表1。

表1 樣品來源表

2 方法

2.1 冬蟲夏草水提液色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-AQ(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～7 min，0%B，7～25 min，0%～18%B，25～30 min，18%～34%B)；流速：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣體積：5 μL。

2.2 冬蟲夏草醇提液色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，2%～8%B，10～20 min，8%～100%B，20～45 min，100%B)；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.3 冬蟲夏草水提液供試品溶液制備 取供試品粉末(過3號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置于10 mL的玻璃管中，精密加入純水5 mL，密塞，搖勻，超聲30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即可。

2.4 冬蟲夏草醇提液供試品溶液制備 取供試品粉末(過3號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置于10 mL的玻璃管中，精密加入甲醇5 mL，密塞，搖勻，超聲30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即可。

2.5 色譜數(shù)據(jù)處理方法 指紋圖譜相似度分析：采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”分析，計(jì)算方法采用中位數(shù)法。聚類分析：采用SPSS軟件進(jìn)行聚類分析，聚類距離采用歐氏距離法，聚類方法采用ward法。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗(yàn) 取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.3”項(xiàng)下制備冬蟲夏草水提液，以水作為空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下分析測(cè)定(見圖1)。從圖1中可看到空白溶液在各主要色譜峰出峰位置處均無干擾，表明冬蟲夏草水提液指紋圖譜檢測(cè)方法專屬性良好。

圖1 冬蟲夏草水提液指紋圖譜專屬性試驗(yàn)色譜圖

注：A.冬蟲夏草水提液；B.空白水溶液；1-7.共有峰

取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.4”項(xiàng)下制備冬蟲夏草醇提液，以甲醇作為空白溶液，按“2.2”項(xiàng)下分析測(cè)定(見圖2)。從圖2中可看到空白溶液在各主要色譜峰出峰位置處均無干擾，表明冬蟲夏草醇提液指紋圖譜檢測(cè)方法專屬性良好。

圖2 冬蟲夏草醇提液指紋圖譜專屬性試驗(yàn)色譜圖

注：A.冬蟲夏草醇提液；B.空白甲醇溶液；1-8.共有峰

3.1.2 精密度試驗(yàn) 取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.3”項(xiàng)下制備冬蟲夏草水提液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定冬蟲夏草水提液指紋圖譜。結(jié)果以4號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含7個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，峰面積比RSD小于3.7%，相似度系數(shù)均大于0.9，表明精密度良好。

取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.4”項(xiàng)下制備冬蟲夏草醇提液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定冬蟲夏草醇提液指紋圖譜。結(jié)果以8號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含8個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.8%，峰面積比RSD小于5.0%，相似度系數(shù)均大于0.90，表明精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取冬蟲夏草樣品(S1)6份，按“2.3”項(xiàng)下制備冬蟲夏草水提液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定?？疾鞓悠分?個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，峰面積比RSD小于5.7%，相似度系數(shù)均大于0.90，表明方法重復(fù)性良好。

取冬蟲夏草樣品(S1)6份，按“2.4”項(xiàng)下制備冬蟲夏草醇提液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。考察樣品中8個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.8%，峰面積比RSD小于5.7%，相似度系數(shù)均大于0.90，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.3”項(xiàng)下制備冬蟲夏草水提液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0，1，2，3，4，5，6 h測(cè)定其指紋圖譜。對(duì)不同進(jìn)樣時(shí)間樣品中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果顯示6 h內(nèi)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.2%，峰面積比RSD小于7.0%，相似度系數(shù)均大于0.90，表明冬蟲夏草水提液供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

取冬蟲夏草樣品(S1)，按“2.4”項(xiàng)下制備冬蟲夏草醇提液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件在0，4，8，12，18，24 h測(cè)定其指紋圖譜。對(duì)不同進(jìn)樣時(shí)間樣品中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果顯示24 h內(nèi)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.5%，峰面積比RSD小于7.4%，相似度系數(shù)均大于0.90，表明冬蟲夏草醇溶性供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

3.2.1 水溶性指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 取冬蟲夏草藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。將10批冬蟲夏草藥材水提液(S1-S10)的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，得到10批藥材260 nm波長(zhǎng)下的液相指紋圖譜，并生成共有模式的對(duì)照指紋圖譜，采用此對(duì)照指紋圖譜對(duì)20批冬蟲夏草樣本(S1-S20)及2批發(fā)酵蟲草菌絲粉樣本(S21-S22)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)(圖3)，20批冬蟲夏草樣品的相似度均大于0.90，2批發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的相似度均低于0.90(表2)。

圖3 冬蟲夏草水提液指紋圖譜疊加圖

表2 冬蟲夏草水提液指紋圖譜相似度

3.2.2 醇溶性指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 取冬蟲夏草藥材，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。將10批冬蟲夏草藥材醇提液(S1-S10)的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，得到10批藥材280 nm波長(zhǎng)下的液相指紋圖譜，并生成共有模式的對(duì)照指紋圖譜，采用此對(duì)照指紋圖譜對(duì)20批冬蟲夏草樣本(S1-S20)及2批發(fā)酵蟲草菌絲粉樣本(S21-S22)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)(圖4)，20批冬蟲夏草樣品的相似度均大于0.90，2批發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的相似度均低于0.90(表3)。

圖4 冬蟲夏草醇提液指紋圖譜疊加圖

表3 冬蟲夏草醇提液指紋圖譜相似度

3.3 聚類分析

3.3.1 冬蟲夏草水提液樣品聚類分析 運(yùn)用SPSS軟件對(duì)22批冬蟲夏草水提液樣品共有峰峰面積色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用ward法，以歐式距離法作為樣品相似度距離公式，結(jié)果見圖5。22批樣品被分為2類：Ⅰ類為冬蟲夏草樣品(S1-S20)，Ⅱ類為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉(S21-S22)。

圖5 冬蟲夏草水提液樣品聚類分析樹狀圖

圖6 冬蟲夏草醇提液樣品聚類分析樹狀圖

3.3.2 冬蟲夏草醇提液樣品聚類分析 運(yùn)用SPSS軟件對(duì)22批冬蟲夏草醇提液樣品共有峰峰面積色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用ward法，以歐式距離法作為樣品相似度距離公式，結(jié)果見圖6。22批樣品被分為2類：Ⅰ類為冬蟲夏草樣品(S1-S20)，Ⅱ類為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉(S21-S22)。

4 討論

4.1 色譜條件優(yōu)化 冬蟲夏草水提液中存在大量大極性成分，在反向色譜模式下需要用100%水溶液做流動(dòng)相才可有效分離，但常規(guī)反向色譜柱在純水流動(dòng)相條件下會(huì)造成色譜柱損壞，無法完成大極性成分分離工作。根據(jù)本觀察組前期結(jié)果顯示Agilent ZORBAX SB-AQ色譜柱在純水條件下可以有效分析冬蟲夏草中的大極性化合物，因此本實(shí)驗(yàn)選用了該款色譜柱作為分析柱[20]；流動(dòng)相系統(tǒng)比較了水-乙腈系統(tǒng)和0.1%甲酸水溶液-乙腈系統(tǒng)，結(jié)果顯示流動(dòng)相中添加甲酸，有利于色譜峰的分離；同時(shí)也比較了不同柱溫(25 ℃和35 ℃)對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果兩者無明顯區(qū)別，本文選擇了室溫25 ℃作為實(shí)驗(yàn)條件；檢測(cè)波長(zhǎng)主要參照前期冬蟲夏草水溶性指紋圖譜文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

冬蟲夏草醇提液中醇溶性成分較多，本實(shí)驗(yàn)通過初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用Waters X-bridge色譜柱及水-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)即可對(duì)供試品成分進(jìn)行較好的分離。通過比較柱溫25 ℃和35 ℃,結(jié)果顯示35 ℃時(shí)色譜分離較好，因此選擇其作為分析條件；檢測(cè)波長(zhǎng)采用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品色譜圖進(jìn)行全波長(zhǎng)分析，發(fā)現(xiàn)280 nm色譜峰較多，峰形較好，故選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 冬蟲夏草指紋圖譜數(shù)據(jù)分析 通過比較20批冬蟲夏草(S1-S20)和2批發(fā)酵蟲草菌粉(S21-S22)水提液及醇提液相似度系數(shù)(表2、表3)，可以發(fā)現(xiàn)10批野生冬蟲夏草樣品(S1-S10)、5批市售野生冬蟲夏草樣品(S11-S15)和5批冬蟲夏草繁育樣品(S16-S20)在水溶性成分和醇溶性成分上均具有較好的一致性(相似度系數(shù)大于0.93)，均可有效區(qū)分發(fā)酵冬蟲夏草菌粉樣品(相似度系數(shù)小于0.82)。進(jìn)一步對(duì)20批冬蟲夏草(S1-S20)和2批發(fā)酵蟲草菌粉(S21-S22)水提液及醇提液共有色譜峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析結(jié)果(圖5、圖6)，發(fā)現(xiàn)20批冬蟲夏草藥材包括10批野生采集樣品、5批市場(chǎng)采購(gòu)樣品和5批繁育樣品在水提液色譜數(shù)據(jù)和醇提液色譜數(shù)據(jù)上均聚為一類，具有較好的一致性，同時(shí)和發(fā)酵冬蟲夏草菌粉色譜數(shù)據(jù)又有明顯的區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)建立的冬蟲夏草水提液和醇提液指紋圖譜方法可以從水溶性成分和醇溶性成分2個(gè)方面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的品質(zhì)，有助于提升冬蟲夏草的全面質(zhì)量控制水平。

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HPLCFingerprintsAnalysisofAqueousExtractandMethanolExtractofCordyceps

Qian Zhengming1, Sun Mintian1, Li Hua2, Liu Xiaoxiao2, Li Wenqing1, Li Wenjia1

(1KeyInstituteofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SunShineLakePharmCo.,Ltd,Dongguan523850,China; 2GuangdongInstituteforDrugControl,Guangzhou510180,China)

Objective:To establish chemical fingerprints of the aqueous extract and methanol extract of Cordyceps by HPLC.MethodsThe aqueous extract and methanol extract of 20 batches Cordyceps and 2 batches Cordyceps mycelium were analyzed by HPLC. The chromatographic data was evaluated by similarity analysis and cluster analysis.ResultsThe aqueous extract and methanol extract chemical fingerprints of Cordyceps were developed. Seven common peaks were identified in aqueous extract and eight common peaks were identified in methanol extract. The similarities of 20 batches Cordyceps aqueous extract and methanol extract were higher than 0.9, and the similarities of 2 batches Cordyceps mycelium were lower than 0.9. The cluster analysis result showed that Cordyceps and Cordyceps mycelium were separated in different clusters.ConclusionThe developed HPLC fingerprint method is stable and reliable, which helps to the comprehensive quality evaluation of Cordyceps.

Cordyceps; Aqueous extract; Methanol extract; HPLC; Fingerprint

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.069

國(guó)家工信部中藥材提升和保障領(lǐng)域項(xiàng)目——冬蟲夏草規(guī)?；a(chǎn)基地建設(shè)

李文佳(1982.11—)，女，碩士,工程師，研究方向：中藥資源與開發(fā)，E-mail：LiWenjia@hec.cn

(2017-08-31收稿 責(zé)任編輯：徐穎)