馮 將，魏玉好，余 波，周思璇,，姜玲玲，王 魯*

(1.貴州大學(xué) 貴州省生化工程中心，貴陽 550025；2.貴州省銅仁市江口縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所， 貴州江口 554400；3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005)

中藥復(fù)方及拆方的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌活性評價

馮 將1,2，魏玉好1，余 波3，周思璇1,3，姜玲玲3，王 魯1*

(1.貴州大學(xué) 貴州省生化工程中心，貴陽 550025；2.貴州省銅仁市江口縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所， 貴州江口 554400；3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005)

為了研究中藥復(fù)方及其拆方的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌活性，本研究采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型及冰醋酸致小鼠毛細(xì)血管滲透方法觀察其對炎癥的影響；采用醋酸致小鼠扭體試驗及熱板法觀察其對疼痛的影響；采用二倍稀釋法檢測其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度( MIC) 和最小殺菌濃度(MBC)。抗炎結(jié)果表明中藥復(fù)方及拆方對二甲苯致炎小鼠的耳腫脹度和小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性降低差異不顯著 (P>0.05)；鎮(zhèn)痛結(jié)果顯示中藥復(fù)方組、拆方都能極顯著的減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)，但對熱刺激引發(fā)的小鼠痛反應(yīng)時間無明顯的延長 (P>0.05)作用；抑菌實驗表明中藥復(fù)方在0.63 mg/mL濃度以上時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很好的抑菌效果，對沙門氏菌呈中度敏感，其MIC為9.375 mg/mL，但拆方抑菌效果不明顯。研究表明中藥復(fù)方及其拆方組合具有一定的鎮(zhèn)痛及抗菌活性。

中藥復(fù)方；拆方；抗炎；鎮(zhèn)痛；抑菌

本研究的中藥復(fù)方(止痢散)是以多葉勾兒茶為主藥，輔以地榆、烏藥等中草藥，經(jīng)配方而成新復(fù)方中藥制劑。多葉勾兒茶作為傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、活血止痛、抑菌等藥理作用[1-2]，地榆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。地榆中含有多種天然活性物質(zhì)，主要藥理作用有抗炎、抗菌、消腫、抗腫瘤、止血及增強(qiáng)免疫等[3]。有研究報道地榆可顯著降低IL-1β水平，升高IL-10水平，且明顯下調(diào)NF-κB蛋白活性，治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎效果顯著[4]。烏藥為傳統(tǒng)常用中藥，是重要的溫胃理氣止痛藥之一，具有抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)消化道、興奮心肌、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[5]。前期我們研究止痢散對實驗性腹瀉及胃腸運(yùn)動的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)止痢散可以有效地抑制機(jī)體的胃腸運(yùn)動使腸蠕動減緩，從而起到抗腹瀉的作用[6]。此外，進(jìn)一步研究止痢散及其拆方對胃腸運(yùn)動的影響，結(jié)果表明止痢散及其拆方的抗腹瀉作用是與其抑制腸推進(jìn)和胃排空，減小腸平滑肌收縮張力有關(guān)，但都不能對抗痙攣性胃腸運(yùn)動[7]。為了進(jìn)一步研究中藥復(fù)方及其拆方的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用，豐富其藥理學(xué)作用，本研究觀察了其對二甲苯致小鼠耳腫脹模型及冰醋酸致小鼠毛細(xì)血管滲透實驗抗炎作用、醋酸致小鼠扭體實驗及熱板法實驗鎮(zhèn)痛作用及對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制效果，以期為中藥復(fù)方在臨床上的進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF 級昆明小白鼠( 動物許可證號為SCXK(渝)2012-0003) ，18～22 g，雌雄兼用，購自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，在貴州大學(xué)貴州省生化工程中心SPF 級動物實驗室(動物使用許可證號: SYXK(黔) 2013-0001) 飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 止瀉復(fù)方制劑由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)研究室提供；規(guī)格：200 g/袋，每1 g本品相當(dāng)于原生藥4.7 g；成分：多葉勾兒茶，萹蓄，烏藥，地榆。冰醋酸(安徽深藍(lán)醫(yī)療科技股份有限公司)；阿司匹林(上海穎心實驗設(shè)備有限公司，批號：100113)；冰醋酸(安徽深藍(lán)醫(yī)療科技有限公司)；伊文思蘭(廣州化學(xué)試劑廠，批號20101217)；生理鹽水(北京科友佳生物技術(shù)有限公司)、營養(yǎng)瓊脂(上海博微生物科技有限公司，批號：140316)；10%胰酪胨大豆肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3101010)。

1.3 儀器 電子天平(北京賽多利斯天平儀器廠)；KQ3200電熱恒溫水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；LS-B75立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)；DHG-9230A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；HH-B11-360電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；分光光度計Thermo Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；打孔器(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn))等。

1.4 供試菌株 大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC13565)、沙門氏菌(ATCC14028)，均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方 法

2.1 止痢散、多地、多地烏對實驗性炎癥影響的試驗

2.1.1 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹抑制的測定 取小鼠140只，雌雄各半，隨機(jī)均分7組。即空白對照組，陽性對照組，中藥復(fù)方低、中、高劑量組，多地組(多葉勾兒茶和地榆配藥前搖勻，按照2∶1的體積比配)、多地烏組(多葉勾兒茶、地榆和烏藥配藥前搖勻，按照10∶5∶2的體積比配成)。陽性對照組按0.2 g/kg給予地塞米松混懸液，空白對照組給予等量生理鹽水，中藥復(fù)方給藥組分別按0.8、0.4、0.2 g/kg 灌胃給藥，多地組、多地烏按0.4 mL/20 g灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5 d。參考文獻(xiàn)[8]方法計算腫脹度及腫脹抑制率。

2.1.2 醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性抑制的測定 分組及給藥方法同2.1.1項，參考文獻(xiàn)[8]方法計算各組抑制率。

2.2 止痢散、多地、多地烏對實驗性疼痛影響的試驗

2.2.1 醋酸致小鼠扭體反應(yīng)抑制的測定 分組及給藥方法同2.1.1項，空白對照組予等容量生理鹽水灌胃，陽性對照組按0.2 g/kg 給予阿司匹林混懸液，每日1 次，連續(xù)5 d，參考文獻(xiàn)[8]計算抑制率。

2.2.2 熱痛閾值影響的測定 取體重18～22 g 雌性昆明小鼠，熱板溫度保持在(55±0.5)℃，測定每只小鼠的痛閾值(即痛反應(yīng)潛伏期，指小鼠接觸熱板至舔后足的時間)。痛閾值在5～30 s 內(nèi)為合格小鼠。痛閾合格小鼠分組及給藥方法同2.2.1項，于末次給藥1 h 后，分別測定每只30、60 min小鼠的痛閾值。以動物出現(xiàn)舔后爪行為作為痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄自投入熱板到出現(xiàn)舔后爪的潛伏期，連續(xù)測3次，取平均值，為痛閾值。

2.3 止痢散、多地、多地烏對3種細(xì)菌MIC、MBC的測定 采用試管二倍稀釋法進(jìn)行。將中藥復(fù)方(2.5 mg/mL)、中藥組合(150 mg/mL)營養(yǎng)肉湯相混合，按倍比稀釋法稀釋至2～7共8個稀釋度，每管2 mL然后將上述盛有藥液與培養(yǎng)基混合物的試管在 121 ℃下高壓滅菌 30 min 后，分別接種實驗菌液(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)濃度為108CFU/mL的菌懸液0.02 mL，同時設(shè)置加菌液不加藥液的陽性對照和加藥液不加菌懸液的陰性對照，各組試管置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，參考文獻(xiàn)[9]測定MIC和MBC。

3 結(jié) 果

3.1 止痢散、多地、多地烏對實驗性炎癥影響的結(jié)果

3.1.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹抑制的結(jié)果 結(jié)果如表1所示，與空白對照組相比，陽性藥物組能極顯著的抑制小鼠的耳廓腫脹度，腫脹抑制率為63.70%，中藥復(fù)方低、中、高劑量組抑制率分別為3.59%、10.33%和13.46%，也有降低小鼠耳廓腫脹度的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異；多地、多地烏劑量組抑制率分別為4.45%和4.02%，也有降低小鼠耳廓腫脹度的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異；陽性藥物組對小鼠耳廓腫脹的抑制明顯強(qiáng)于中藥復(fù)方各劑量組和拆方組合的多地組與多地烏組(P<0.01)。

表1 中藥復(fù)方及其拆方對二甲苯致小鼠耳廓腫脹結(jié)果 Tab 1 Result of compound prescription of traditional Chinese medicine and its disassembled prescription on mouse ear swelling induced by xylene

**表示與對照組相比P<0.01；##表示與陽性組比P<0.01

**P<0.01, vs. control group;##P<0.01, vs. positive group

3.1.2 對醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性抑制的結(jié)果 結(jié)果如表2所示，與空白對照組相比，陽性藥物組能極顯著的減少小鼠毛細(xì)血管中的伊文思藍(lán)含量(P<0.01)，對血管通透性的抑制率為46.45%，中藥復(fù)方中劑量和高劑量組抑制率分別為6.45%和16.13%，具有抑制毛細(xì)血管通透性的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異；陽性藥物組對小鼠毛細(xì)血管通透性的抑制明顯強(qiáng)于中藥復(fù)方各劑量組和拆方組合的多地組與多地烏組(P<0.01) 。

表2 中藥復(fù)方及其拆方對小鼠毛細(xì)血管通透性影響結(jié)果 Tab 2 Result of Chinese herbal compound and its disassembled prescriptions on capillary permeability in mice

**表示與對照組相比P<0.01；##表示與陽性組比P<0.01。

**P<0.01, vs. control group;##P<0.01, vs. positive group

3.2 止痢散、多地、多地烏對實驗性疼痛的影響

3.2.1 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)抑制的結(jié)果 結(jié)果如表3所示，與空白對照組相比，陽性藥物組、中藥復(fù)方低劑量組、多地組和多地烏組能極顯著的減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)，中藥復(fù)方的鎮(zhèn)痛率可達(dá)21.21%，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，表明中藥復(fù)方鎮(zhèn)痛效果明顯；其多地、多地烏劑量組也能極顯著的減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)，鎮(zhèn)痛率可達(dá)24.79%、31.52%；陽性藥物組小鼠扭體次數(shù)極顯著低于中藥復(fù)方各劑量組和拆方組合的多地組與多地烏組(P<0.01)。

3.2.2 對熱痛閾值的影響結(jié)果 結(jié)果如表4所示，與空白對照組相比，陽性藥物組在30 min能極顯著(P<0.01)提高小鼠痛閾值；陽性藥物組在30 min提高的小鼠痛閾值極顯著(P<0.01)高于中藥復(fù)方低、中、高劑量組、多地組和多地烏組(P<0.01)。與空白對照組相比，給藥后1 h，陽性藥物組、中藥復(fù)劑量組和拆方組合多地組、多地烏組無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 中藥復(fù)方及其拆方的止痛效果Tab 3 Analgesic effect of Chinese herbal compound and its prescription

**表示與對照組相比P<0.01；##表示與陽性組比P<0.01

**P<0.01, vs. control group;##P<0.01, vs. positive group

表4 中藥復(fù)方及其拆方對小鼠痛閾的影響結(jié)果 Tab 4 Result of Chinese herbal compound and its prescription on pain threshold in mice

**表示與對照組相比P<0.01；##表示與陽性組比P<0.01

**P<0.01, vs. control group;##P<0.01, vs. positive group

3.3 止痢散、多地、多地烏對3種細(xì)菌MIC、MBC的測定結(jié)果 在本試驗中，中藥復(fù)方對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)為較敏感，其MIC為0.63 mg/mL；止痢散對沙門氏菌的MIC為9.375 mg/mL。多地、多地烏劑量組對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC為150 mg/mL。在本試驗中，止痢散對大腸桿菌的MBC為0.9375 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為0.625 mg/mL，止痢散對沙門氏菌的MBC為37.50 mg/mL，多地、多地烏均無明顯殺菌作用。

4 討論與小結(jié)

炎癥反應(yīng)參與許多疾病的基本病理過程，臨床表現(xiàn)為病變部位的紅、腫、熱、痛和功能障礙及間或伴有不同程度的全身性反應(yīng)。疼痛是機(jī)體受到不良刺激或損傷后產(chǎn)生的信號和反應(yīng)，是許多疾病常見的癥狀。藥物的鎮(zhèn)痛作用一般以物理性(熱、電、機(jī)械) 或化學(xué)性的刺激引發(fā)疼痛反應(yīng)，通過監(jiān)測藥物對疼痛反應(yīng)的影響以評價藥效。許多研究報道，炎癥反應(yīng)和疼痛常常相伴而生，并互相影響。大量的臨床研究及實驗證明，很多中藥具有很好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。而中藥的抗炎作用機(jī)制表現(xiàn)為多種途徑，主要有丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)功能、干擾花生四烯酸代謝、抑制炎性介質(zhì)、抗血栓生成等[10]。中藥的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制主要有減少外周致痛物質(zhì)及誘導(dǎo)痛敏物質(zhì)的分泌、減輕局部致痛物質(zhì)的堆積、增加外周內(nèi)源鎮(zhèn)痛物質(zhì)的釋放、調(diào)節(jié)c-fos基因、增加阿片肽類的含量、抑制第二信使神經(jīng)遞質(zhì)NO的釋放、降低腦組織中前列腺素E2(PGE2)的含量、提高 5-HT 的含量等[11]。

俞浩等[12]研究地榆炮制前后水提物抗炎作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生地榆和地榆炭水提物均能抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹、冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高。汪群紅等[13]研究烏藥的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。發(fā)現(xiàn)烏藥可明顯減少小鼠扭體次數(shù)，明顯降低大鼠肉芽腫、明顯降低小鼠耳廓腫脹率、明顯降低大鼠足腫脹度，說明烏藥具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。本研究采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型及冰醋酸致小鼠毛細(xì)血管滲透試驗觀察其對炎癥的影響；通過醋酸致小鼠扭體試驗及熱板法試驗觀察其對疼痛的影響。結(jié)果顯示中藥復(fù)方及其中藥組合能減輕二甲苯所引起的小鼠耳廓腫脹，其抑制率為13.46%、4.45%和4.02%；對毛細(xì)血管通透性具有抑制的趨勢，抑制率為16.13%和4.84%，但無統(tǒng)計學(xué)差異。本試驗研究還發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方及其拆方能極顯著抑制小鼠的扭體次數(shù)，中藥復(fù)方的鎮(zhèn)痛率可達(dá)21.21%，多地、多地烏劑量組鎮(zhèn)痛率可達(dá)24.79%、31.52%，但對熱板致小鼠疼痛的抑制效果不顯著。多葉勾兒茶、地榆和烏藥這三味的組方與這些作用機(jī)制有關(guān)，但中藥復(fù)方發(fā)揮作用往往是通過多種途徑來實現(xiàn)的，而本方是否存在通過其它途徑而起效，這三味對抗炎、鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的直接貢獻(xiàn)如何，都有待進(jìn)一步研究。

中藥由于成分的復(fù)雜性和作用的多樣性，其抗菌機(jī)制的研究目前還比較淺顯，研究手段也比較局限。中藥既可以直接抑殺細(xì)菌，又可以通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力而發(fā)揮抑菌作用[14]。近幾年的研究表明，中藥抗菌作用機(jī)制主要有干擾細(xì)胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細(xì)胞蛋白合成、影響核酸合成、抗毒力與免疫防御、干擾遺傳密碼復(fù)制等[15]。研究中藥對病原菌的體外抑菌活性試驗方法很多，一般采用的方法有管碟法、固體培養(yǎng)基法、紙片抑菌法、平皿稀釋法以及瓊脂擴(kuò)散法等，它們通常只用于對中藥的抑菌活性作定性研究，定量分析常用二倍稀釋法[16]。Gundidza等[17]利用杯碟法、試管法研究發(fā)現(xiàn)B.discolor的水、石油醚、氯仿、二氯甲烷提取物對葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠球菌均有抑制活性，其中水提取物的活性最為顯著。本試驗研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方在0.63 mg/mL濃度以上時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很好的抑菌效果，對沙門氏菌呈中度敏感，其MIC分別9.375 mg/mL。然而，中藥組合抑菌效果不明顯，這可能與中藥相互配伍確可出現(xiàn)其藥效增強(qiáng)、不變和減弱的有關(guān)。

目前，以多葉勾兒茶為主的家畜新獸藥止痢散的開發(fā)利用還鮮見報道，本研究對其抗炎、鎮(zhèn)痛和抑菌作用進(jìn)行了初步評價，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供了數(shù)據(jù)參考，也為研制較為理想的抗腹瀉類新獸藥提供了數(shù)據(jù)參考。

中藥復(fù)方及拆方組合對二甲苯所引起的小鼠耳廓腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性、熱板致小鼠疼痛無明顯抑制作用，但能極顯著抑制小鼠的扭體次數(shù)。止痢散對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均具有抑菌效果，但其拆方組合抑菌效果不明顯。

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EvaluationofAnti-inflammatory,AnalgesicandBacteriostaticActivitiesof
ChineseHerbalCompoundandItsDisassemblePrescription

FENG Jiang1,2, WEI Yu-hao1, YU Bo3, ZHOU Si-xuan1,3, JIANG Ling-ling3, WANG Lu1*

(1.BiochemistryEngineeringCenterofGuizhouProvince,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 2.InstituteofAnimalHealthSupervisionofJiangkoucounty,Jiangkou,Guizhou554400,China; 3.HusbandryandVeterinaryResearchInstitute,Guiyang550005,China)

WANGLu,E-mail:wanglu7007@163.com

In order to study the anti-inflammatory, analgesic and bacteriostatic effects of Chinese herbal compound and its disassemble prescription, it is used the acute inflammatory models such as xylene-induced ear edema and blood capillary leakage of abdominal cavity on mice to study inflammatory effect , and used acetic acid writhing method and hot plate method to study the analgesic effect on mice, and used trace double dilution method to measure the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) ofEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandSalmonella. The anti-inflammatory results showed Chinese herbal compound and its disassemble prescription could not extremely significantly reduce the degree of ear swelling of mice induced by xylene and the permeability of abdominal capillary (P>0.05).The analgesic results showed both Chinese herbal compound and its disassemble prescription could significantly reduce the number of writhing times (P<0.01), but there was no significant increase in the response time of mice induced by thermal stimulation (P>0.05). Bacteriostatic results showed Chinese herbal compound had better antibacterial effect onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusabove the concentration of 0.63 mg/mL, and it was moderately sensitive toSalmonellawith its MIC 9.375 mg/mL. However, its disassemble prescription inhibitory effect was not obvious. It is conclused Chinese herbal compound and its disassemble prescription has certain analgesic and antibacterial activity.

Chinese herbal compound; disassemble prescription; anti inflammation; analgesia; bacteriostasis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.06

2017-04-12

A

1002-1280 (2017) 12-0030-06

S853.74

貴州省重大專項(黔科合重大專項字[2013]6014);貴州省農(nóng)業(yè)類工程技術(shù)研究中心項目(黔科合農(nóng)G字[2015]4001)

馮 將，碩士研究生，從事中藥藥理學(xué)研究。

王 魯。E-mail: wanglu7007@163.com

(編輯：陳希)