徐 嫄，韓寧寧，于麗娜，戴 青，趙 暉，楊秀玉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

管碟法測(cè)定吉他霉素含量的不確定度評(píng)定

徐 嫄，韓寧寧，于麗娜，戴 青，趙 暉，楊秀玉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

建立了管碟法測(cè)定吉他霉素含量不確定度的評(píng)定方法。通過建立數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用測(cè)量不確定度評(píng)定與表達(dá)理論，分析不確定度來源，對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算擴(kuò)展不確定度，得到測(cè)定結(jié)果的不確定度報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果可表示為(1636.2±11.1)U/mg(k=2)，測(cè)量不確度的主要來源為溶液的制備過程。

吉他霉素；管碟法；不確定度

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。測(cè)量不確定度對(duì)于實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)、測(cè)量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)及檢測(cè)工作國際化等方面都具有重要意義。ISO/IEC17025標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有并應(yīng)用評(píng)定測(cè)量不確定度的程序，在國家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的評(píng)審過程中，測(cè)量不確定度報(bào)告同樣被關(guān)注。本文根據(jù)相關(guān)技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻(xiàn)[2-8]，對(duì)管碟法測(cè)定吉他霉素效價(jià)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定，以期為試驗(yàn)方法的優(yōu)化和準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)測(cè)量結(jié)果提供參考。

1 儀器與試藥

抗生素效價(jià)測(cè)量儀(北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司，CHB-1)；分析天平(METTLER-TOLEDO，AX-205)，37 ℃恒溫培養(yǎng)室；鋼管自動(dòng)放置器(北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司，ZY-300G)；吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，1462 U/mg，批號(hào)0357-9901)；吉他霉素供試品(企業(yè)提供)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501](中國藥品生物制品檢定所)；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)，滅菌0.9%氯化鈉溶液，滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京中海動(dòng)物保健科技公司)；乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液的制備 依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》[9]2015年版一部抗生素微生物檢定法配制。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品置50 mL容量瓶中，按吉他霉素每2 mg加乙醇1 mL使溶解，用滅菌水稀釋至刻度，搖勻制得每1 mL中含1000 U的溶液；精密量取該溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻；再分別精密量取該溶液10 mL，分別置50 mL和100 mL容量瓶中，加滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含40 U和20 U的溶液，分別作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高、低劑量。供試品溶液的制備：精密稱定吉他霉素供試品，按上述方法制備，得每1 mL含40 U和20 U的溶液，分別作為供試品溶液的高、低劑量。

2.2 雙碟的制備與培養(yǎng) 取平底雙碟8(n)套，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL，放置在水平臺(tái)面上使凝固，作為底層；另取加熱溶化后溫度降至約50 ℃的培養(yǎng)基適量，加入65 ℃保溫30 min的枯草芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻；在凝固好的底層培養(yǎng)基上加入5 mL該含菌培養(yǎng)基，使攤步均勻，作為菌層；凝固后，在雙碟中等距離安置不銹鋼小管4(k)個(gè)，靜置穩(wěn)定后，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，將雙碟置37 ℃恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)16～18 h。

2.3 抑菌圈直徑的測(cè)定與效價(jià)計(jì)算 用效價(jià)測(cè)量儀測(cè)量各抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法[9]進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算。當(dāng)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 吉他霉素效價(jià)測(cè)定抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果Tab 1 diameter of antibacterial circles in potency assay of Kitasamycin

3 測(cè)量不確定度的評(píng)定

3.1 數(shù)學(xué)模型

3.2 測(cè)量不確定度來源分析 測(cè)量不確定度來源的分析常從數(shù)學(xué)模型入手，該數(shù)學(xué)模型中的各個(gè)參數(shù)可能都有一個(gè)與其數(shù)值相關(guān)的不確定，成為不確定度的潛在來源。從樣品的稱量到抑菌圈的測(cè)定，不確定度的來源除抑菌圈直徑測(cè)量值引起的輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度外，還包括標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)、溶液的配制、玻璃儀器和定量移液器的校準(zhǔn)、溫度、效價(jià)測(cè)量儀等。

3.3 測(cè)量不確定度的評(píng)定

3.3.1 抑菌圈直徑測(cè)量的不確定度分量

3.3.1.1 抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量 對(duì)抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)上述公式計(jì)算效價(jià)(Pt)為1636.2 U/mg(可信限率3.3%)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定n個(gè)培養(yǎng)皿，牛津杯個(gè)數(shù)k，統(tǒng)計(jì)分析得自由度f=(k-1)(n-1)，其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urelx1=0.856/1636.2=0.00052。

3.3.2 溶液配制的不確定度分量

吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為1462 U/mg，根據(jù)矩形分布，置信概率為95%，按B類不確定度計(jì)算。

100 mL容量瓶經(jīng)檢定為A級(jí)，容量允差為±0.10 mL，根據(jù)矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度為，

3.3.2.2 供試品溶液的不確定度分量 同3.3.2.1項(xiàng)的方法計(jì)算。供試品的稱量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

uc(y)=0.0034×1636.2 U/mg=5.56 U/mg。

3.5 擴(kuò)展不確定度 取包含因子k，P=95%，則擴(kuò)展不確定度為U=2×5.56 U/mg=11.1 U/mg。報(bào)告吉他霉素含量測(cè)定結(jié)果可表示為：(1636.2±11.1)U/mg(k=2)。

4 小 結(jié)

通過對(duì)管碟法測(cè)定吉他霉素含量結(jié)果的不確定度評(píng)定，可知該方法測(cè)定結(jié)果的不確定度的主要來源是溶液的制備過程。提示實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作過程，保證天平、玻璃量具等的穩(wěn)定和可靠，控制實(shí)驗(yàn)條件，如環(huán)境溫度；并且注意，在溶液配制過程中，盡量減少稀釋次數(shù)和避免采用小體積量器進(jìn)行量取和定容。該實(shí)驗(yàn)過程中需要尤為注意的是，在吉他霉素母液配制時(shí)，經(jīng)乙醇溶解后加入滅菌水定容的過程中，應(yīng)避免液體溫度升高導(dǎo)致溶劑體積變大而影響定容的準(zhǔn)確性，應(yīng)在適量加入滅菌水后，待溶液溫度降至室溫后再定容至刻度線。通過吉他霉素含量不確定度評(píng)定，能夠更加清楚影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素，幫助判斷結(jié)果的準(zhǔn)確度，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高檢驗(yàn)工作的質(zhì)量。

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 中華人民共和國國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].

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General Administration of Quality Supervision Inspection and Quarantine of the People's Republic of China. JJG196-2006 Common Glass Container Verification Procedures[M]. Beijing：China Metrology Publishing House,2006.

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The State Bureau of Technical Supervision of China. Guide to the Evaluation and Presentation of Measurement Uncertainty[M]. Beijing：China Metrology Publishing House,2003.

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Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia (2015) [M]. Beijing：China Agricul Ture Press,2016.

UncertaintyEvaluationintheAssayofKitasamycinbyDiffusionMethod

XU Yuan，HAN Ning-ning，YU Li-na，DAI Qing，ZHAO Hui，YANG Xiu-yu*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

YANGXiu-yu,E-mail：yangxiuyu@ivdc.org.cn

A procedure for the evaluation in the assay of kitasamycin by diffusion method was developed. A mathematical model of uncertainty evaluation was established which was used to analyze the sources of uncertainty and to evaluate every component in the determination procedure by the application of theory of evaluation and expression of the uncertainty of measurement. The expanded uncertainty was calculated and the uncertainty report was submitted. The result of content determination can be expressed as(1636.2±11.1)U/mg(k=2). The main sources of uncertainty came from preparation of solutions.

kitasamycin；diffusion method；uncertainty

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.10

2017-04-06

A

1002-1280 (2017) 12-0052-05

S859.2

徐 嫄，碩士，從事獸藥檢驗(yàn)工作。

楊秀玉。E-mail：yangxiuyu@ivdc.org.cn

(編輯：侯向輝)