丁俊仁，李思聰，李旭廷，王 斌，楊 銳，詹素瓊，梁 歌*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

參金口服液大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)研究

丁俊仁1,2，李思聰1,2，李旭廷1,2，王 斌1,2，楊 銳1,2，詹素瓊1,2，梁 歌1,2*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

為評(píng)價(jià)參金口服液的安全性，采用Sprague Dawley (SD)大鼠開展了亞慢性毒性試驗(yàn)。120只SD大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為高、中、低劑量和空白對(duì)照組，藥物組分別按64、32、16 g/kg體重灌胃給藥，空白對(duì)照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥28 d，停藥后觀察14 d。結(jié)果表明，高劑量組出現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，停藥后可恢復(fù)正常，其余相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)均未見異常。表明參金口服液在臨床應(yīng)用是安全的。

參金口服液；大鼠；亞慢性毒性

新生仔豬腹瀉發(fā)病率高，病死率高，病因復(fù)雜，單純的抗生素治療收效甚微，開發(fā)新型中獸藥制劑已成為研究熱點(diǎn)[1-3]。參金口服液由黨參、金銀花、干姜、半夏、藿香、甘草、茯苓、陳皮、白術(shù)等組成，經(jīng)水醇提取法提取后，加工制成口服液，具有芳香化濕、和胃止嘔之功效，用于脾胃不和與霍亂吐瀉之證。為評(píng)價(jià)參金口服液的安全性，參照文獻(xiàn)[4]方法設(shè)計(jì)開展了大鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)，為該制劑的安全性評(píng)價(jià)和獸醫(yī)臨床使用安全劑量的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g；SD大鼠，SPF級(jí)，鼠齡5～6周，體重90～100 g，雌雄各半。均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK[川]2013-058。飼養(yǎng)溫度20 ℃～26 ℃，濕度45%～65%，光照條件12 h/12 h明暗交替，通風(fēng)次數(shù)≥15次/h。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 參金口服液提取物(由黨參15 g、金銀花10 g、干姜10 g、半夏15 g、藿香10 g、甘草10 g、茯苓10 g、陳皮10 g和白術(shù)10 g組成，加水煎煮，制成每1 g含原生藥3.2 g的提取物)，由四川省畜牧科學(xué)研究院自制。用純化水配成濃度為3.2 g生藥/mL藥液(達(dá)到最大可抽吸濃度)。

1.1.3 主要試驗(yàn)器材 全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BC-6800，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(BS-420，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，電解質(zhì)分析儀(AFT-500，梅州康立高科技有限公司)。血凝儀(CA-550，日本希森美康公司)。ALC-1100.2型電子天平(Max：1100 g，d=0.01 g)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2015，德國(guó))、數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn) 采用最大給藥劑量法測(cè)試小鼠急性毒性。SPF級(jí)昆明種小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和提取物組，每組10只，對(duì)照組給蒸餾水，給藥組灌服參金口服液，一日之內(nèi)灌胃3次(間隔3 h)，每次0.2 mL/10 g。給藥后常規(guī)觀測(cè)14 d，觀察指標(biāo)包括小鼠的飲食及飲水情況、精神狀況、死亡、被毛色澤、糞便性狀和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)等。計(jì)算最大耐受倍數(shù)。

1.2.2 大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)

1.2.2.1 分組與處理 120只大鼠分為4組(高、中、低劑量組和空白對(duì)照組)，每組雌雄各半，高、中、低劑量組分別按照64、32和16 g/kg劑量灌胃給藥，每日一次，空白對(duì)照組灌服等體積蒸餾水。給藥28 d后，每組股動(dòng)脈采血20只，采血完畢后處死，進(jìn)行病理觀察；余下動(dòng)物，停藥觀察14 d。

1.2.2.2 指標(biāo)觀察及樣品檢測(cè)

1.2.2.2.1 一般觀察 每日觀察記錄給藥前、后大鼠外觀體征、行為活動(dòng)等，給藥后重點(diǎn)觀察動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)癥狀及其癥狀的出現(xiàn)和消失時(shí)間。每周稱量體重兩次，統(tǒng)計(jì)飼料消耗。

1.2.2.2.2 血常規(guī)和生化學(xué)指標(biāo) 給藥第28 d和停藥后第14 d各組分別抽取20只和10只(雌雄各半)，采血后處死。測(cè)定WBC(白細(xì)胞)、RBC(紅細(xì)胞)、HGB(血紅蛋白)、HCT(紅細(xì)胞壓積)、PLT(血小板計(jì)數(shù))、PT(凝血酶原時(shí)間)。AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALP(堿性磷酸酶)、TP(總蛋白)、Alb(清蛋白)、TBIL(總膽紅素)、BUN(尿素氮)、Glu(葡萄糖)、TC(總膽固醇)、Crea(肌酐)、Na+、K+、Cl-和CK(肌酸激酶)。

1.2.2.2.3 組織病理學(xué)檢查 各組采集的主要臟器稱重后用10%甲醛固定，HE染色，做病理組織檢查。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分析處理所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算用SPSS13.0軟件，采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 給藥后，小鼠活動(dòng)減少，糞便顏色深，個(gè)別有稀便，但第2 d均恢復(fù)正常，持續(xù)觀察14 d，所有小鼠生理活動(dòng)正常，無中毒和死亡發(fā)生，病理剖檢無眼觀病理變化，小鼠最大給藥劑量達(dá)到192 g(原生藥)/kg體重。

2.2 反復(fù)給藥參金口服液對(duì)大鼠一般觀察和體重的影響 給藥期間，各組大鼠精神、行為、分泌物等與對(duì)照組相比無明顯變化，高、中劑量組偶有稀便，個(gè)別大鼠肛周毛色深染，試驗(yàn)期間未有死亡。停藥觀察無遲發(fā)性不良反應(yīng)。各組體重均有增加，試驗(yàn)組體重增長(zhǎng)略低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3 反復(fù)給藥參金口服液對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響 給藥結(jié)束，各組血液學(xué)指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表1 參金口服液對(duì)大鼠體重的影響(g)Tab 1 Effects of the Shenjin liquid on body weights of rats (g)

表2 參金口服液對(duì)大鼠血常規(guī)的影響Tab 2 Effects of the Shenjin liquid on the haematological of rats

2.4 反復(fù)給藥參金口服液對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響(表3) 給藥期間，與空白對(duì)照組相比，高劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)顯著升高(P<0.05)，高、中、低劑量組血糖(Glu)有減少的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。停藥觀察2周，各組各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。

表3 參金口服液對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)影響Tab 3 Effects of Shenjin liquid on blood biochemical index of rats

與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.5 反復(fù)給藥參金口服液對(duì)大鼠各臟器指數(shù)的影響及組織學(xué)檢查結(jié)果 試驗(yàn)期間各組大鼠的臟器指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，結(jié)果見表4 。給藥結(jié)束，中、低劑量組和對(duì)照組各主要器官外形、色澤均正常，胸腔、腹腔、心包及臟器之間無積液或黏連，無充血、出血、腫脹和壞死等肉眼可見病變。停藥后各組主要臟器切片觀察無明顯變化。

表4 參金口服液對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響Tab 4 Effects of Shenjin liquid on the main organ indexes of rats

3 討 論

參金口服液組方源自 “半夏藿香湯”，“半夏藿香湯”收載于明末著名溫病學(xué)家吳又可編撰的《瘟疫論》中，具有芳香化濕、和胃止嘔之功效，主治痰邪留于胸膈，胃氣虛寒，溫疫下后，脈靜身涼，不渴不燥，用于脾胃不和與霍亂吐瀉之證。新生仔豬腹瀉病因復(fù)雜，病毒性腹瀉和大腸桿菌腹瀉是主要致病因素，低溫和管理不善加重腹瀉的發(fā)生，臨床治法常采用清熱解毒、化濕止痢、澀腸止瀉等，代表性組方有止痢散、烏梅散等。新生仔豬機(jī)體各功能不成熟，尚需外界干燥保溫才能存活，若過度采取清熱解毒的治法易耗傷正氣，尤其是損傷脾胃陽氣，劫奪津液，容易導(dǎo)致陰傷。因此在組方思路上選擇具有芳香化濕、和胃止嘔之功效“半夏藿香湯”為基礎(chǔ)方，調(diào)減金銀花用量并增加黨參補(bǔ)中益氣、和胃生津，調(diào)補(bǔ)因泄瀉所致的正氣虧虛。臨床實(shí)踐證明，該方對(duì)新生仔豬腹瀉防治效果較好，為進(jìn)一步明確其臨床用藥安全性，開展了大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)研究。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示參金口服液對(duì)小鼠口服最大耐受劑量為單次給藥劑量為64 g/kg體重，24 h內(nèi)累計(jì)給藥(3次)劑量為192 g/kg體重，顯示本品實(shí)際無毒[5-6]。因未能測(cè)出LD50，故大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)高劑量設(shè)置仍選擇最大給藥劑量，即大鼠按64 g/kg體重單次灌服，相當(dāng)于臨床擬用劑量(豬1.6 g/kg體重)的40倍。

給藥期間，高、中劑量組偶有個(gè)別大鼠出現(xiàn)稀糞，被毛臟亂和灌胃后蜷縮現(xiàn)象。高、中劑量組大鼠的體重增長(zhǎng)減緩，飼料消耗量呈不同程度的減少，以高劑量最為明顯，表明長(zhǎng)期灌服高濃度參金口服液會(huì)影響大鼠采食，進(jìn)而減緩體重增長(zhǎng)。這種影響應(yīng)與受試藥物濃度和給藥體積相關(guān)(藥液濃稠、給藥體積大，胃腸排空時(shí)間長(zhǎng)，影響胃腸正常消化和進(jìn)食。而相當(dāng)于臨床擬用劑量10倍的低劑量組體重增長(zhǎng)正常，說明參金口服液在臨床劑量條件下使用不會(huì)對(duì)采食和生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是一種催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)功能酶，主要分布在肝臟，是衡量肝功能、反映肝臟受損最為重要、敏感的指標(biāo)之一[7]。給藥期間，高劑量組ALT升高，表明長(zhǎng)期灌服高劑量參金口服液對(duì)肝臟功能有一定損害。參金口服液由黨參、金銀花、半夏、干姜等多種中藥組成，其中半夏為天南星科植物半夏的干燥根莖，為中醫(yī)臨床上常用的中藥之一，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功[8]。漢代張仲景在《金匱玉函經(jīng)》中已說明半夏“令水清滑盡, 洗不熟有毒也”，歷代醫(yī)家均認(rèn)同半夏有毒性[9]。張麗美等[10]對(duì)于生半夏肝毒性“時(shí)-毒”關(guān)系的研究顯示，小鼠單次灌胃半夏水提物62.5 g/kg后，其血清ALT、AST 值高峰出現(xiàn)在給藥后4 h，持續(xù)約48 h，說明半夏的肝損害的程度與時(shí)間相關(guān)，肝組織切片形態(tài)學(xué)檢查亦支持此結(jié)果，故可初步確定半夏有肝毒性。本試驗(yàn)所用參金口服液半夏含量遠(yuǎn)低于張麗美等[10]，且采用炮制后半夏，組方中加入干姜溫胃止嘔，同時(shí)以制半夏之悍[12]，故而整體毒性相對(duì)減弱，停藥后各組肝臟指標(biāo)均恢復(fù)正常，說明肝損傷過程可逆。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，參金口服液以64、32、16 g/kg體重(相當(dāng)于擬定臨床日用劑量的40、20、10倍)對(duì)大鼠連續(xù)28 d灌胃給藥，高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，停藥后可恢復(fù)正常，其余相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)均未見由藥物作用引起的異常。結(jié)果顯示參金口服液以臨床劑量在臨床應(yīng)用安全性好。

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(編輯：陳希)

SubchronicToxicityTestofShenjinOralLiquidinRat

DING Jun-ren1,2, LI Si-cong1,2, LI Xu-ting1,2, WANG Bin1,2, YANG Rui1,2,ZHAN Su-qiong1,2, LIANG Ge1,2*

(1.SichuanAnimalScienceAcademy，Chengdu610066,China;2.SichuanKeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding,Chengdu610066,China)

LIANGGe,E-mail:geer1010@126.com

To evaluate the safety of Shenjin oral liquid (SJ) in animal model, we performed the subchronic toxicity test using Sprague Dawley rats. A total of 120 rats were randomly divided into 4 groups (experimental groups: high, medium, low dose groups, and control group). For experimental groups the SJ was administrated once daily by oral gavage at doses of 16, 32 and 64 g/kg, while distilled water was given to rats in the control group. Administration was consecutive for 28 d. The main outcome measures including reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxic effects were observed during the period of administration and within 14 d after withdrawal. Compared with the control group, ALT was significant increased (P<0.05) in the high dose group, while other parameters were normal. The effect of toxicity would recover after drug withdrawal. Our results indicated that administration of SJ was safe in SD rats, suggesting potential safe use in clinic.

Shenjin oral liquid; SD rat; subchronic toxicity.

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.05

2017-03-18

A

1002-1280 (2017) 12-0024-06

S853.74

四川省基本科研項(xiàng)目(SASA2015A17)；四川省財(cái)政運(yùn)行專項(xiàng)(SASA2014CZYX010)

丁俊仁，碩士，從事中獸藥方面研究。

梁 歌。E-mail：geer1010@126.com