崔云龍

（嘉吉生化有限公司，吉林松原 138000）

篩選具有淀粉酶活力的菌株及其誘變

崔云龍

（嘉吉生化有限公司，吉林松原 138000）

利用篩選培養(yǎng)基在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)1號稻草中篩選出1株具有淀粉酶活性的芽孢，再利用紫外線（波長254nm）對出發(fā)菌株10號進(jìn)行誘變處理，誘變后記錄致死率，分別為54.24%、69.07%、72.88%、86.02%、88.98%、91.95%。再用DNS法檢測酶活力，通過吸光度計算確定150s產(chǎn)多糖最多，為最佳誘變時間。最高活力酶的產(chǎn)糖量為14.4U，此時致死率為88.98%，比原菌株還原糖產(chǎn)量增長114.3%。

紫外誘變；篩選；淀粉酶

淀粉酶（amylase）是在高溫高壓的條件下，作用于淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的酶[1]。根據(jù)水解的方式不同可分為α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）與β-淀粉酶（EC3.2.1.2．）[2-3]。α-淀粉酶廣泛存在于動物的唾液、胰臟，植物的麥芽及微生物中[4]。微生物產(chǎn)生的酶大部分都是分泌性的[5]。

玉米在世界的糧食生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地位。目前，玉米產(chǎn)品用途廣泛，其在國內(nèi)外加工業(yè)中已達(dá)數(shù)千個品種，食品、工業(yè)生產(chǎn)處處可見玉米的身影；玉米深加工產(chǎn)品已發(fā)展到多個層次，隨著科技的發(fā)展和自動化的應(yīng)用，所加工出的產(chǎn)品廣度和深度日益加深，使得經(jīng)濟(jì)和實(shí)用價值不斷增加。

芽孢菌在較為惡劣的情況下，可以形成特定的休眠體——抗逆性芽孢，芽孢本身的抗逆性所以具有頑強(qiáng)的生命力及對特定環(huán)境的適應(yīng)能力，借助于基因組的破譯和遺傳系統(tǒng)的建立，使之成為較為固定的載體。目前，國內(nèi)外主要利用微生物培養(yǎng)篩選來生產(chǎn)淀粉酶。雖然各種微生物也能產(chǎn)生專一性葡聚糖酶，但絕大多數(shù)菌株的酶系對大多淀粉酶無特異性，能特異分解淀粉酶的菌株主要來源于芽孢菌屬和曲霉屬。但由于產(chǎn)量很低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，本試驗(yàn)利用紫外線誘變處理芽孢菌10號期望能夠得到多糖高產(chǎn)菌株，解決產(chǎn)量低的難題。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)1號稻草中篩選篩選而出，共20株，選其中第10株作為本實(shí)驗(yàn)的菌種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉1g，瓊脂20g，定容至1 000mL，調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌30min。

平板固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉1g，瓊脂20g。定容至1 000mL，調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌30min。

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉10g。定容至1 000mL，調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌30min。

1.3 儀器設(shè)備及藥品

儀器設(shè)備：超凈工作臺、恒溫?fù)u床、常速離心機(jī)、紫外燈、紅燈、高壓滅菌鍋、電子天平、試管若干、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、電爐、干燥箱、722分光光度儀等。

所用藥品：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、NaOH、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)1號稻草、3,5-二硝基水楊酸試劑等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的篩選

將收集來的吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)1號稻草用蒸餾水浸泡24h后，取出浸泡液煮沸2min，將濃度稀釋到10-4，均勻地涂布在平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12h，存活的即為芽孢桿菌。分別接入到5mL液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。之后進(jìn)行酶活力的初步檢測。確定活力最佳的菌株為第10號，用該株進(jìn)行誘變。

1.4.2 劃線培養(yǎng)

取活化后的斜面菌種10號，接種于平板固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12h。

1.4.3 誘變前菌液稀釋濃度的確定

菌株平板培養(yǎng)12h后，挑單菌落接入裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管里，37℃恒溫培養(yǎng)箱12h。稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，再經(jīng)過涂平板培養(yǎng)12h后，10-6、10-7、10-8出現(xiàn)單斑，10-7為最佳誘變濃度。

1.4.4 紫外誘變

菌株平板培養(yǎng)12h后，選擇單獨(dú)菌落利用液體培養(yǎng)基試管內(nèi)培養(yǎng)，恒溫37℃培養(yǎng)12h。稀釋到原濃度的10-7涂平板，每個平板用量為0.1mL，共準(zhǔn)備7份，將培養(yǎng)皿置于波長為254nm約l5W紫外燈下20cm處。照射時間分別為30s、60s、90s、120s、150s、180s。37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光倒置培養(yǎng)12h。進(jìn)行菌落計數(shù)，上述操作進(jìn)行3次，取平均值，計算至死率。

1.4.5 恒溫發(fā)酵培養(yǎng)方法

在對照平板和誘變后的平板中分別挑取與出發(fā)菌株相比較菌落直徑大、周邊呈稠厚狀者為生長與產(chǎn)還原糖性能較優(yōu)良的純種的菌落。一部分用于接種斜面培養(yǎng)基保留菌種，另一部分接種于裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管中，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37℃恒溫培養(yǎng)箱12h。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖濃度分析

葡萄糖濃度采用光度法分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將少許分析純（AR）葡萄糖（約1g）放在一個小的表面皿內(nèi)放入烘箱，100℃干燥30min。取出后放在一個小干燥器內(nèi)，冷卻。準(zhǔn)確稱量1.000g去水恒重的葡萄糖，溶解，稀釋并定容到500mL，此標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為0.2%。

取11支刻度試管，加入0.2%葡萄糖溶液、水及3,5-二硝基水楊酸試劑，上述試劑混勻后，在沸水浴中加熱5min，取出立即用冰水冷卻，以蒸餾水稀釋至25mL，搖勻，于540nm測光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以光密度植為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.2 酶活力的測定

將上述各誘變時間段的菌液3 000r/min離心取上清液0.1mL，加入到1%可溶性淀粉溶液2mL中，浸提在37℃水浴中保溫30min，每5min振蕩一次。取出后在沸水浴中加熱5min后冷卻到室溫，再加入3,5-二硝基水楊酸試劑3mL。在沸水浴中加熱5min后冷迅速冷卻到室溫，定容至25mL，測OD值。結(jié)果依次為0.172、0.161、0.155、0.185、0.177、0.192、0.173。根據(jù)吸光度確定最佳誘變時間及最大活力菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外照射對菌株誘變的影響

在波長254nm條件下，不同時間的紫外照射，出發(fā)菌株10號芽孢菌的誘變死亡率如圖2所示。

圖2 致死率曲線

由圖2可見，隨著紫外線照射時間的延長，即處理劑量的增大，菌體的死亡率逐漸提高，圖2中時間150s處最高。為了提高孢子的誘變率，所以確定150s為最佳的誘變時間。

2.2 紫外照射對菌株誘變后的淀粉酶活力的影響

在不同誘變時長的紫外照射，出發(fā)菌株10號桿菌在誘變后的淀粉酶活力如圖3所示。

圖3 酶活力曲線

圖3可得出，正向突變共出現(xiàn)了兩個峰值，呈現(xiàn)曲線的趨勢。在150s時最高達(dá)到14.4U（U=葡萄糖濃度×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時間）。紫外線的照射時間與菌株的致死率、正突變存在著一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著照射時間的延長，致死率會逐漸提高，正突變也會隨之相應(yīng)的變化。誘變率高，致死率也相對高，為了提高孢子的誘變率，所以選擇相對較高的致死率，所以也可確定150s為最佳的誘變時間。

3 結(jié)論

紫外線誘變是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的誘變方法之一。其誘變效應(yīng)主要是由于它引起DNA的結(jié)構(gòu)改變，阻礙DNA的復(fù)制或引起堿基排列次序的變化，從而引起基因突變。從紫外線誘變選育突變株到液體培養(yǎng)、檢測酶活，整個試驗(yàn)有很多需要注意的問題，由于吸光率可以直接反映出該菌株產(chǎn)多糖的性能，所以在試驗(yàn)過程中應(yīng)充分考慮到各種影響因素，減少誤差，以保證所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在操作過程中，尤其在進(jìn)行紫外線誘變時，要保證不染菌，誘變時間準(zhǔn)確，誘變距離相同。在接液體培養(yǎng)時，接菌要單一，接菌量相同，選擇長勢良好的菌株，培養(yǎng)時要避光，溫度濕度要掌握好，培養(yǎng)時間也要相同，減少誤差。

[1]鐘萬芳,萬繼朝,郭慧芳,等.廣譜高效Bt菌株的篩選及殺蟲蛋白基因的克隆[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,26(4):40-42.

[2]吳繼星,陳在佴,張志剛.蘇云金桿菌WG-001工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選[J].微生物學(xué)雜志,2005,25(3):91-94.

[3]Reichert J M,Paquette C.Clinical development of therapeutic recombinant proteins[J].Biotechniques,2003,35(1):182-185.

[4]金明飛,朱欣華,金麗,等.利用degQ基因提高枯草芽孢桿菌纖溶酶表達(dá)[J].微生物學(xué)報,2005,32(2):69-72.

[5]Turnbull P C B.Current status of immunization against anthrax:old vaccines may be here to stay for a while[J].Curr Opin I nfect Dis,2000,13(2):113-120.

Sieving the Starch of Amylase Vigor and its Mutagenesis

Cui Yun-long
(Cargill Bio-Chemical Co.,Ltd,Jilin Songyuan 138000)

Using the screening culture medium to screen the bud spore which has the amylase vigor in JiLin Agricutural College 1 straw.Then using ultraviolet ray(wave length254nm)to mutate the embarksstrain.bud pore fungus 10,after mutagenesis,recording the lethality ratios is 54.24%，69.07%，72.88%，86.02%，88.98%，91.95%using DNS law to examine the enzyme vigor again,through absorbance computation,determined 150s produce the polysaccharide to be most,150s is the best mutagenesis time .The sugar quantity which produced by the highest vigor enzyme is 14.4U,this time the lethality ratios is 88.98%.The strain is better than the embarksstrain,its reducing sugar production has enhanced to 114.3%.

UV mutagenesis;Extraction;Amylase

TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0032-03

崔云龍（1985—），男，吉林敦化人，本科，助理工程師，研究方向：淀粉及淀粉糖產(chǎn)品。